非小细胞肺癌中铁蛋白轻链的表达及价值研究肺癌是目前全球发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一[1],预后极差,年龄标准化5年生存率仅为16.1%[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)作为肺癌中最主要的组织类型,寻找新的生物标记物、评估NSCLC患者预后十分必要。铁蛋白在人体各组织中广泛存在,目前被认为是一种肿瘤相关蛋白,其由2种不同的亚基构成,分别为H型亚基即铁蛋白重链和L型亚基即铁蛋白轻链(FTL)[2]。铁蛋白具有强大的结合铁和储备铁的功能,除了在铁代谢过程中起作用外,其在血管形成、细胞增殖及免疫抑制中也有重要作用[3],在许多恶性肿瘤中检测到铁蛋白高表达,且与肿瘤的转移、侵袭、对化疗药物抗性及不良预后相关[3,4]。相关研究表明血清铁蛋白在骨髓瘤[5]、肝癌[6]、前列腺癌[7]、胃癌[8]、肺癌[9]等患者中差异性表达,有助于其临床诊断及预后评估。作为铁蛋白的重要构成成分,FTL与NSCLC的关系尚未见报道。本研究经免疫组化了解FTL在NSCLC组织中表达情况,探讨FTL高表达与NSCLC患者预后的相关性。1、材料与方法1.1组织样本收集2008年至2018年天津市宝坻区人民医院病理科组织标本,均为已经完成石蜡包埋的组织蜡块,术后病理诊断为NSCLC者,其中癌组织61例,癌旁组织51例。统计61例肺癌组织标本的临床病理资料,定量资料以中位数为分组值,其中病理诊断为肺鳞状细胞癌的患者23例,肺腺癌的患者38例;年龄<60岁28例,≥60岁33例;女性20例,男性41例;吸烟17例,不吸烟44例;肿瘤直径<3.5cm30例,≥3.5cm31例;依据第8版国际肺癌TNM分期标准:Ⅰ～Ⅱ期36例,Ⅲ～Ⅳ期25例。1.2免疫组化常规石蜡切片,制片4μm厚,脱蜡并行抗原修复,3%双氧水阻断内源性过氧化物酶,3%BSA进行血清封闭,滴加一抗FTL抗体(抗体按1∶200稀释,抗体购自Abcam公司),湿盒内4℃孵育过夜;滴加山羊抗兔二抗(1∶200稀释),室温孵育50min;DAB显色后苏木素复染,脱水封片,光学显微镜观察并拍照(显微镜:NIKONEclipseCi,成像系统:NIKONdigitalsightDS-FI2,摄片倍数:200×),苏木素染细胞核为蓝色,DAB显出的阳性表达为棕黄色。组织切片半定量分析方法:组织切片中细胞为淡黄色至棕褐色者为阳性细胞标志。染色强度以多数细胞呈现的染色特性(染色深浅需与背景着色情况相对比)计分:无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。阳性细胞百分比即某类细胞5个视野(200×)的阳性细胞平均数:0～5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分。每张切片随机取5个200倍视野,每个视野均进行染色强度计分与阳性细胞百分比计分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积:0分为阴性(-),1～4分为弱阳性(+),5～8分为中度阳性(++),9～12分为强阳性(+++)。计算评分的ROC曲线最佳截断点6.1为分组值,评分≤6.1为低表达组,评分>6.1为高表达组。1.3Kaplan-MeierPlotter生存分析利用Kaplan-MeierPlotter在线数据库评估FTL的表达与NSCLC患者总生存期(OS)及无进展生存期(PFS)的关系,绘制生存曲线并计算风险比(HR)和Log-RankP值。筛选数据过程为:(1)Cancer:lungcancer;(2)Genesymbol:FTL;(3)探针选择JetSet,AffymetrixID:212788_x_at;(4)Survival:OS和PFS;(5)Followupthreshold:60months。设置在不同截尾值OS或PFS,分别分析FTL在肺鳞癌和腺癌中的预后作用及不同临床分期下FTL与肺癌患者预后的关系。1.4统计学方法使用SPSS20.0进行统计学分析。χ2检验评估FTL在癌组织和癌旁组织中表达的差异性及癌组织中FTL表达与临床病理学特征之间的关系。生存分析采用Kaplan-MeierPlotter在线数据库绘制生存曲线并进行Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。2、结果2.1FTL在NSCLC癌组织和癌旁组织表达的差异免疫组化检测结果显示,FTL在NSCLC组织中的高表达率72.1%(44/61)高于癌旁组织中高表达率为[33.3%(17/51),χ2=16.859,P<0.01]。见表1、图1。2.2FTL表达与NSCLC患者临床病理特征之间的关系以NSCLC癌组织中FTL表达量的中位数为分组值,将61例患者分为FTL低表达组和FTL高表达组,两组年龄、性别、吸烟、肿瘤直径、病理类型、临床分期及TNM分期差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。2.3FTL高表达与NSCLC预后的关系利用Kaplan-MeierPlotter在线数据库分析,分别绘制1926例患者的OS生存曲线及982例患者PFS生存曲线,结果显示FTL高表达的NSCLC患者OS低于FTL低表达患者[P=0.0008,HR=1.27(1.10～1.45)](图2a),而FTL的表达水平与患者PFS无明显相关性[P=0.2256,HR=1.13(0.93～1.37)](图2b)。分析FTL表达水平与NSCLC病理组织学之间的关系。分别绘制720例肺腺癌患者OS生存曲线和461例肺腺癌患者PFS生存曲线;524例肺鳞癌患者OS生存曲线和141例肺鳞癌患者PFS生存曲线,结果显示,FTL的表达与肺腺癌患者的OS及PFS均相关,其表达越高生存越差[P=0.0000,HR=2.20(1.69～2.86);P=0.0006,HR=1.74(1.27～2.40)](图2c、2d)。而FTL的表达与肺鳞癌患者OS及PFS均无关[P=0.3642,HR=1.13(0.87～1.46);P=0.8637,HR=1.05(0.62～1.77)](图2e、2f)。进一步分析FTL表达水平与NSCLC患者临床分期的关系,将截尾值设置为OS,绘制相应生存曲线,其结果显示FTL表达水平与临床Ⅰ期和Ⅱ期患者预后相关[P=0.0000,HR=2.12(1.56～2.87);P=0.0000,HR=2.22(1.49～3.32)],而与临床Ⅲ期患者预后无关[P=0.6747,HR=1.13(0.63～2.03)](图3),数据库中Ⅳ期患者4例,样本太少无法做生存分析。将截尾值设置为PFS,结果显示FTL与Ⅰ期患者预后相关[P=0.0154,HR=1.74(1.11～2.74)],与Ⅱ期患者预后无关[P=0.4359,HR=0.81(0.48～1.37)](图4),Ⅲ期患者19例,Ⅳ期患者0例,均因样本太少无法做生存分析。截尾值无论为OS还是PFS,FTL表达均与早期患者预后具有更好的相关性,且FTL表达水平越高其生存越差。3、讨论肺癌早期临床表现不明显,发现时多已至中晚期,导致肺癌患者预后极差。NSCLC作为肺癌的主要病理类型,探究新的生物标记物在NSCLC患者的诊断治疗和远期预后评估中具有十分重要的意义。FTL作为铁蛋白的重要亚基之一,在人体内铁的的代谢和铁储存中起重要作用[2],其变化必然影响细胞组织的铁摄取和释放,进而可能导致其他分子生物学的变化,参与一系列病理过程和疾病的发生发展。同样,当细胞的结构和功能发生改变时,也会影响FTL的表达水平,因此,FTL的变化可能预示着一些疾病的发生。相关报道表明FTL与肿瘤坏死因子α(TNF-α)及肿瘤抑制基因p53之间存在相互作用[10,11]。已有大量研究结果显示FTL与多种疾病相关,Bertoli等[12]研究表明FTL在AML和白血病干细胞中过表达,认为铁蛋白可能通过激活核因子κB(NF-κB)信号传导,氧化应激,激活炎性细胞因子参与白血病的发生发展。而对FTL自身抗体的检测表明在整个消化道肿瘤尤其肝癌患者中表达增高[13]。对于一些癌前病变,如肠上皮化生亦检测到高水平的FTL表达[14],可见FTL对消化道肿瘤患者早期筛查诊断具有重要意义。Jézéquel等[15]通过CD68和FTL的免疫组化比较,得出结论:FTL是具有侵袭性表型的乳腺肿瘤的标志物,基于蛋白质组学研究结果显示FTL是淋巴结阴性乳腺癌的独立预后标记物[16]。其他相关报道还提示FTL与前列腺癌[17]、卵巢癌[18]、头颈部肿瘤[19]等关系密切。以上研究均提示FTL参与人体多种肿瘤的发生、发展,并在患者预后中扮演着重要的角色。表1FTL在NSCLC组织和癌旁组织中的表达表2FTL表达与61例NSCLC患者临床病理特征的关系图1免疫组化检测FTL表达结果对比(SP法,×200)图2在线数据库NSCLC、肺腺癌与肺鳞癌患者OS、PFS生存曲线图3在线数据库不同临床分期肺癌患者OS生存曲线图4在线数据库不同临床分期肺癌患者PFS生存曲线FTL与NSCLC之间的关联目前鲜有研究。本研究对61例NSCLC癌组织及51例癌旁组织进行免疫组化检测,半定量评分发现FTL在癌组织中表达量明显高于癌旁组织,这可能预示FTL在NSCLC的发生发展中亦有一定作用。继续研究显示,癌组织中FTL表达量与患者相关临床病理参数(年龄、性别、吸烟、肿瘤大小、临床分期、TNM分期)之间并无明显相关性,此结果可能与样本量较少有关,有待大样本的进一步研究去评估。用Kaplan-MeierPlotter在线数据库进行生存分析,结果显示FTL与NSCLC患者OS相关而与患者PFS无关,且FTL高表达组OS低于FTL低表达组;FTL表达量与肺鳞状细胞癌患者OS及PFS均无关,而与肺腺癌患者OS及PFS均相关。在不同临床分期中,截尾值无论是OS还是PFS,均表明FTL的表达量对肺癌早期患者具有更好的预后价值。综上所述,FTL在NSCLC癌组织中高表达,与NSCLC患者预后密切相关,对临床判断NSCLC患者预后情况具有重要价值。参考文献：[5]王海颖,李永伟.血清叶酸､铁蛋白监测在多发性骨髓瘤诊治中的价值研究[J].中国现代医学杂志,2016,26(19):117-119.[6]袁星星,姜菲菲,贾泳梅,等.血清铁蛋白和甲胎蛋白及甲胎蛋白异质体-L3单项与联合检测对原发性肝癌辅助诊断的临床应用价值[J].中华检验医学杂志,2016,39(8):604-608.[7]薛冬,周萃星,陆皓,等.血清铁蛋白与前列腺癌骨转移的关系[J].中华实验外科杂志,2016,33(6):1507-1509.[8]王竞,崔桂荣,刘为平.血清铁蛋白对胃癌的诊断价值[J].现代中西医结合杂志,2015,24(36):4047-4048.[9]汪硕敏,顾康生.血清癌胚抗原､铁蛋白和糖基抗原199在非小细胞肺癌诊断中的临床价值[J].安徽医科大学学报,2018,53(9):1444-1447.[11]张洁,张永泽,柳彩芝,等.铁蛋白轻链真核表达载体的构建[J].生物技术,2014,24(1):4-7.[13]王晓蕊,张春霞,任鹏飞,等.消化道肿瘤患者抗FTL自身抗体检测及诊断意义[J].中国公共卫生,2013,29(5):666-668.[17]陈宁,陈晨,李治国,等.铁蛋白轻链在前列腺癌中的表达及意义[J].贵州医药,2016,40(6):569-571.[18]蒋金朋.上皮性卵巢癌患者铁代谢状态研究[D].荆州:长江大学,2018.[19]冯国飞,梁瑜珊,钟素华,等.转铁蛋白受体1在头颈肿瘤中的表达及其意义[J].广西医科大学学报,2019,36(5):691-695.曾广,张文成,王广舜.铁蛋白轻链在非小细胞肺癌中的表达及意义[J].中国临床研究,2020,33(06):749-753.
