探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种含有四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，能够催化多种酚类和非酚类的化合物[1,2,3]，因此在造纸漂白[4,5]、染料脱色[6,7]、食品加工[8]、环境保护[9]等领域有广阔的应用前景。但是，自然界的野生菌漆酶存在酶活低、产量低、培养周期长、高温易失活等问题，导致其难以应用于工业生产。随着分子生物学和基因组学的迅猛发展，通过定向进化技术来提高漆酶表达量、催化能力、稳定性及底物特异性等;寻找合适的载体进行漆酶基因的异源表达来提高表达量，都是目前解决问题的有效方法[10,11,12]。定向进化是一种在实验室模拟达尔文进化的过程，通过对基因进行突变或重组，建立突变库以筛选到性能更好的蛋白，是一种最有前途的提高漆酶表达和性能的方法[13]。酿酒酵母因其操作简单，生产成本低，分泌表达易于纯化，能对表达蛋白进行加工、修饰等诸多优点脱颖而出，成为目前最主要的外源蛋白表达宿主之一[14]。此外，酿酒酵母因不产生毒素，安全性好，成为一种与人类生活密切相关的酵母，广泛应用于食品工业和生物医药领域[15]。作为真核生物的模式菌，酿酒酵母全序列的测定已于1996年完成，是目前了解最完全的真核生物[16]。因此，本章通过对漆酶Lcc转录调节区域进行突变，并将pYES2-Lcc突变质粒转化酿酒酵母进行异源表达，构建酿酒酵母菌株突变库，利用以ABTS为底物的酶活检测筛选方法，筛选出高酶活、高表达量的突变菌株。1、材料与方法1.1菌株和质粒大肠杆菌BL21Gold(DE3)、酿酒酵母INVSc1菌株由本实验室保存，重组载体pYES2-Lcc由本实验室构建。1.2酶和试剂EasyTaqDNAPolymerase、10×EasyTaqBuffer、2.5mMdNTPs、基因Marker(Trans15KDNAMarker)购自TransGenBiotech公司;质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司;酵母质粒小提试剂盒、无氨基酵母氮源(YNB)购自Solarbio公司。胰蛋白胨Tryptone、酵母提取物YeastExtract购自英国OXOID公司;琼脂糖Agar购自Sigma公司;2,2’-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)购自Coolaber公司;其它试剂均为国产分析纯。1.3培养基(1)YPAD培养基:1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，0.004%硫酸腺嘌呤，121℃灭菌15min。(2)SC-U培养基:0.67%无氨基酵母氮源，2%碳源(葡萄糖或棉子糖)，0.01%(腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸，色氨酸)，0.005%(天冬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，酪氨酸，缬氨酸)，固体培养基添加2%Agar,121℃灭菌20min。(3)HC预培养基:10%10×YNB,10%10×HCdropoutsolution,20%200g/Lgalactose,10%1mol/LpH值6.2KH2PO4-KOH缓冲液，50%去离子水。(4)HC表达培养基:10%10×YNB,10%10×HCdropoutsolution,20%200g/Lgalactose,10%1mol/LpH值6.2KH2PO4-KOH缓冲液，0.2%0.25mol/L,59.8%去离子水，过滤除菌。1.4Lcc转录调节序列突变库构建将实验室保藏的大肠杆菌BL21/pYES2-Lcc划线于LB(Amp)固体平板，挑取单克隆接种于LB(Amp)液体培养基，并于37℃、200r/min的恒温摇床中过夜培养。利用质粒小提试剂盒提取pYES2-Lcc质粒，作为易错PCR的模板DNA，以fwlcc-调节区域为上游引物，其碱基序列为5’-GTGGAAGCGGTATTCGCAATG-3’,rev-lcc-调节区域为下游引物，其碱基序列为5’-GAGCTCGGTACCAAGCTTAATATTCC-3’。反应体系:TemplateDNA(50ng/μL)2μL,10μMForwardPrimer2μL,10μMReversePrimer2μL,10×EasyTaqBuffer10μL,2.5mMdNTPs8μL,EasyTaqDNAPolymerase2μL,10mMMn2+,ddH2O71μL,total100μL。反应条件:94℃3min;94℃30s,58℃30s,72℃2min，共30个循环;72℃10min。每个小离心管装25μL，放入PCR仪，反应结束后，取2μL产物利用1%核酸胶电泳检测验证，通过胶回收纯化回收目的条带，命名为Lcc-ep．并将其重组到质粒上，取1μL重组质粒电转入大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，电击后加入1mLLB液体培养基混匀，37℃、200r/min摇床中孵育1h，分别涂布于含有Amp的LB固体平板(Amp抗性筛选)，37℃恒温培养箱倒置过夜培养。收集到的菌体用质粒小提试剂盒抽提质粒，按其说明书操作。1.5酿酒酵母的转化用LiAc/SS载体DNA/PEG法高效转化冷冻活性酵母细胞，具体操作步骤如下:将配制好的ssDNA从-20℃冰箱取出，沸水中煮5min，使其变性，取出后立即放入冰浴备用;将-80℃保藏的感受态细胞取出，放于37℃水中15～30s,13000r/min离心2min，去除上清，依次加入下列:260μL50%(w/v)PEG3350,36μL1.0mol/LLiAc,50μL2.0mg/mLssDNA,14μL待转化的质粒(pYES2-Lcc-ep)及无菌水，360μL总体积;用移液器充分混匀，放于42℃水浴20～60min;13000r/min离心30s，去除上清;加入1mLYPAD液体培养基重悬，放入30℃水浴2～3h;取200μL重悬液涂布于SC-U平板，30℃培养3～4天，即可长出转化子。1.6重组酿酒酵母的诱导表达及其筛选表达:待SC-U平板长出转化子后，用无菌牙签随机挑取转化子接种到含150μL的HC预培养基(含Amp,Kan)的96孔板(平底)中，封口，30℃，800r/min摇床培养2天，并做空白、空质粒、野生型对照;用复制器复制到含180μL的HC表达培养基(含Amp,Kan)的96孔板(尖底)中，20℃，800r/min摇床培养3天;剩余菌液加入50μL50%甘油，-80℃冰箱保存。96孔板筛选:从表达好的重组酿酒酵母96孔板中，取出20μL菌液到新的96孔板，再加入180μL去离子水，用酶标仪测波长600nm下的吸光度;将96孔板剩余菌液4000r/min,15min离心，以ABTS为底物，以pH值3.0的柠檬酸为缓冲液，在420nm下测定吸光度，按以下体系测酶活力:110μLpH值3.0柠檬酸缓冲液，50μL上清，40μLABTS(7mM)。酶活力单位定义为:1min内催化氧化1μmol底物的酶量为1个酶活单位。筛选到的酶活高于野生型的突变菌株挑选出来，再从原母板用无菌牙签中蘸取菌液进行预培养基、表达培养，测OD600，测ABTS酶活力(步骤同上);摇瓶复筛:复筛到的高活性突变菌株从原母板取50μL菌液接种到3mLHC预培养基，30℃，200r/min培养2天后转接到HC表达培养基(50mL摇瓶/25mL培养基/250μL菌液)，测OD600，收菌，测上清ABTS酶活力。1.7酿酒酵母高活性突变体序列测定酿酒酵母高活性突变体抽提质粒，按酵母质粒提取试剂盒说明书操作;以提取的酿酒酵母高活性突变体质粒为模板做克隆PCR验证(T7promoter、T7terminator商业引物做正反向引物);验证正确的突变体将提取的重组酿酒酵母质粒电转到大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞;当平板上生长出单菌落时，挑取单克隆并接种至LB(Amp)液体培养基中，在37℃、200r/min条件下培养12h;将培养的菌液用质粒小提试剂盒提取大肠质粒，测DNA浓度并进行质粒验证，然后送至公司进行测序，将测序正确的菌株甘油冻存管储存在-80℃冰箱中。1.8漆酶高表达突变株调节区域序列比对将测序结果进行整理，与原始序列进行同源比对，该过程用SnapGene软件完成，统计碱基突变位点。2、结果与讨论2.1重组质粒的构建以pYES2-Lcc质粒为模板，fw-lcc-调节区域、rev-lcc-调节区域分别为上下游引物进行易错PCR，克隆得到的产物，结果如图1所示，epPCR产物条带约1000bp，克隆产物条带约为7602bp，符合预期。该重组质粒及其调节区域如图2所示。图1epPCR产物及克隆产物电泳结果M代表Marker;1-2代表epPCR产物;3-4代表克隆产物图2重组质粒调节区域示意图2.2重组酿酒酵母的筛选对挑取的突变子利用ABTS检测方法进行初筛，以ABTS为底物测得酶活力高于野生型1.3倍的有46株。对46个优势菌株进行96孔板复筛，每个突变体设置4个平行样，获得13个优势突变体;最后对13个优势突变体进行摇瓶复筛，结果如图3所示。其中，酶活是野性型酶活1.5倍以上的突变株有3株，1.29～1.5倍的突变株有7株，1.04～1.2倍的突变株有3株。突变体M1酶活最高，可达35.4U/L。图3野生型和13个优势突变体摇瓶复筛漆酶粗酶液酶活检测结果2.3突变体序列测定及比对为测定13个优势突变体中酶活最高的3株菌株的碱基序列，首先抽提酵母质粒，并对其进行克隆PCR,PCR产物验证电泳图如图4所示。从图中可以看到一条大小约为1500bp的清晰条带，说明酵母质粒提取成功。之后将提取的重组酿酒酵母质粒电转到大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，接种单克隆培养，并抽提质粒，将质粒送公司测序，然后用SnapGene软件整理测序结果，与原序列比对后，发现活性最高的三个突变体在GAL1promoter区域均有突变。因此推断，3个突变体上出现的4个突变加强了启动子与RNA聚合酶的结合，因此加速了漆酶基因的转录能力，从而引起漆酶表达量的提高。图43个优势突变体的酵母质粒菌落PCR结果M代表Marker,1-3代表M1、M2、M3突变体3、结论与展望本章通过对调节漆酶Lcc表达的调节区域进行突变，并将pYES2-Lcc突变质粒转化酿酒酵母进行异源表达，构建酿酒酵母菌株突变库，利用以ABTS为底物的高通量的筛选方法对突变库进行筛选，并对酶活高的突变体进行摇瓶复筛，最终获得了三株遗传稳定的高酶活突变体M1、M2、M3。它们的突变均在GAL1启动子区域，说明启动子上的突变引起了漆酶表达量的提高。通过定向进化转录调节区域，漆酶最高活性可达35.4U/L。参考文献：[1]谭小珊,王帅杰,吴科元,等.刺芹侧耳产漆酶条件优化及对偶氮染料甲基橙的脱色[J].菌物学报,2019,38(10):1702-1709.[2]刘恋,杨清.漆酶的研究进展及其应用[J].山东化工,2019,48(3):60-61.[3]钱磊,张志军.灵芝漆酶研究进展[J].食用菌,2016,38(4):4-6.[5]郑志强.耐热性细菌漆酶的高效表达及其在纸浆生物漂白中的应用[D].无锡:江南大学,2015.[8]胡周月,钱磊,张志军,等.漆酶在食品工业及其他领域上的应用进展[J].天津农学院学报,2019,26(3):83-86.[9]马倩倩,赵丽红,陈威.漆酶在环境保护中的应用研究进展[J].工业安全与环保,2019,45(8):100-103.[10]宫瑾,黄振强,郑意,等.提高酿酒酵母异源蛋白表达及分泌效率的研究进展[J].汕头大学医学院学报,2013,26(3):163-165.[11]刘晓庆,那日,郭九峰.漆酶基因异源表达及其酶活性的研究进展[J].安徽农业科学,2016,44(1):18-21.[12]董欣瑞,秦丽娜,陶勇,等.糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)漆酶POXA1在里氏木霉中的高效表达及酶学性质[J].微生物学报,2012,52(7):850-856.[13]曲戈,赵晶,郑平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