研究分析多肽微球缓释注射剂中载体辅料丙交酯乙交酯共聚物的关键质量属性.docx

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研究分析多肽微球缓释注射剂中载体辅料丙交酯乙交酯共聚物的关键质量属性载体辅料作为多肽微球注射剂的关键组成部分，它决定了药物递送系统的生物可降解性能以及体内药物释放行为。常用的化学合成载体辅料包括聚酯、聚酸酐、聚酰胺、聚磷腈、聚磷酸酯、聚氨基酸等，其中在微球注射剂中应用最多的是聚乳酸（polylacticacid,PLA）和丙交酯乙交酯共聚物（poly(lactide-co-glycolide),PLGA)[1,2,3]。PLA和PLGA种类多样，除了最常见的线型结构，还有星型、多臂型等非直链结构（见图1），其关键质量属性的表征对于确保药物缓释可控以及体内外相关性至关重要。目前，关于多肽微球注射剂中PLGA的质量控制与评价方法研究的报道较少，本文研究了多种肽类微球注射剂中PLGA的分子量、摩尔比与含量、玻璃化转变温度（Tg）等关键质量属性的表征与分析，并探讨PLGA的Tg测定及其影响因素，为多肽微球缓释注射剂的质量控制与药学一致性评价研究提供参考。1、材料与方法1.1样品与试剂微球制剂样品：注射用醋酸兰瑞肽（规格40mg,A公司）、注射用醋酸曲普瑞林（规格3.75mg,B公司）、注射用醋酸丙氨瑞林微球（研发药品，C公司）、注射用醋酸奥曲肽（规格10、20、30mg,D公司）、注射用双羟萘酸帕瑞肽（规格20、40、60mg,E公司）、注射用醋酸亮丙瑞林微球（规格1.88、3.75、11.25mg,F公司）。PLGA样品：PLGA5050-2.5A（批号ResomerSelect5050DLG,Evonic公司）；PLGA5050-3A（批号ExpansorbDLG50-3A,Merk公司）；PLGA5050（批号RESOMER®RG504H,Sigma-Aldrich公司）；PLGA5545（批号AP222,Akina公司）；PLGA6040（批号AP076,Akina公司）；2臂PLGA5545（批号AP245,Akina公司，1,2-己二醇引发合成）；3臂PLGA5545（批号AP229,Akina公司，三羟甲基丙烷引发合成）；4臂PLGA5545（批号AP227,Akina公司，季戊四醇引发合成）；5臂PLGA5545（批号AP236,Akina公司，核糖醇引发合成）；6臂PLGA5545（批号AP228,Akina公司，双季戊四醇引发合成）；PLGA星型（批号ResomerSelect5545DLG,Evonic公司）。图1PLGA构型1.2仪器与耗材仪器：电子天平（型号XP205DR、XPE26、AE-163,Mettler公司）；Waterse2695高效液相色谱仪（2414示差检测器）、工作站Empower3.0(Waters公司）；配有5mmBBO探头的AvanceNeo600MHz核磁共振波谱仪（Bruker公司）；差式扫描量热仪（型号DSC822e,METTLER公司）；GPC-3D:1260型高效液相色谱仪（Agilent公司）、干涉型示差折光仪OptilabT-rEX(Wyatt公司）、18角度激光光散射仪DAWNHELEOS-II(Wyatt公司）、粘度检测仪Viscostar-IIviscometer(Wyatt公司）。耗材：0.22μm滤膜（尼龙66，津腾公司）；0.45μmNY针头式过滤器（批号280633123，岛津技迩商贸有限公司）；凝胶色谱柱：PLgel(5μm,300mm×7.5mm,Agilent公司），PLgel(5μm,10E4Å，300mm×7.5mm,Agilent公司）；线性梯度柱TSKgel®（型号GMHHR-L,7.8mm×30cm,TosohBioscience公司）。1.3实验方法1.3.1PLGA及微球样品相对重均分子质量（relativeweightaveragemolecularweight,MwR）测定[4]凝胶渗透色谱：2根AglientPLgel(300mm×7.5mm）柱子串联。以四氢呋喃为流动相，流速为1mL·min-1，柱温为40℃，示差检测器内部温度为40℃，进样量为100μL。MwR对照品溶液：取聚苯乙烯MwR对照品A（包含MwR分别为364700、103500、19410、4720、1230）和聚苯乙烯MwR对照品B（包含MwR分别为214500、44360、9580、3070、625）各1支，每支加入四氢呋喃5mL，充分溶解后室温静置4h。系统适用性：取MwR对照品A溶液和B溶液作为系统适用性溶液，要求各MwR对照品分离度良好，分离度均大于1.5，拖尾因子小于1.5，峰形良好。样品配制：称取PLGA约10mg，加入四氢呋喃定容至5mL即得PLGA样品；称取微球10mg，加入四氢呋喃定容至5mL，涡旋5min，室温放置12h以上，使PLGA充分溶解，用0.45μm滤膜过滤后，即得微球样品。MwR的计算：采用WatersGPC专用软件绘制标准曲线，以MwR对照品中每个峰的保留时间tR为横坐标，lgMw为纵坐标，得方程：lgMw=AtR+BtR2+CtR3+D依据校正曲线，计算待测样品的MwR。1.3.2丙交酯乙交酯摩尔比（L∶G）及微球中PLGA含量测定[5,6]1HNMR仪器参数：采样参数为90°脉冲，弛豫延迟时间=20s，采样时间=4.2s，温度=298.0K，采样点数=64K，谱宽=δH13，扫描次数NS=32次。核磁信号的归属：选择苯甲酸作为内标物（羧基质子响应信号在δH8.0),PLGA丙交酯单元中次甲基质子的响应信号出现在δH5.2左右，乙交酯单元中亚甲基质子的响应信号出现在δH4.8左右。供试品溶液配制：称取微球3份，每份约10mg，向每份微球样品中加入内标物苯甲酸5mg后，再加入氘代氯仿1mL，涡旋5min，静置2h，使样品充分溶解后转移到核磁管中。计算公式：公式1其中，IBA、ILA、IGA分别是苯甲酸（BA）羧基质子、丙交酯次甲基质子、乙交酯亚甲基质子的峰面积；PBA是BA的纯度，为99.6%;MBA、MLA、MGA分别是BA、脱水乳酸（LA）、脱水乙醇酸（GA）的相对分子质量，分别为122.12、72.08、58.05;Wsample是微球样品的称样量。1.3.3PLGA及微球样品支化度（g′）测定[7]液相色谱：以丙酮为流动相，流速为0.75mL·min-1，用于分离的色谱柱是TSKgel®（型号GMHHR-L,7.8mm×30cm,TosohBioscience公司），柱温30℃，18角度激光光散射仪检测波长设定为660nm、干涉型示差折光仪检测波长为658nm、粘度检测仪温度为25℃，进样量为100μL。样品配制：取供试品约12mg，加入3mL丙酮，放置3h充分溶解后用0.22μm滤膜过滤。支化度（branchingdegree,g′）测定：使用GPC-3D(GPC-三联检测器），依据干涉型示差折光检测器测定的样品吸收度，结合18角度激光检测器测定的MwA和粘度检测器测定的粘度，使用软件Astra7(WyattTechnology）中的BranchingAnalysis功能模块分析线型和非线型样品，进行g′计算。对于非线型样品来说，除了g′，还可以用臂数（numberofarms,B）来表示不同支化程度的聚合物。1.3.4PLGA及微球样品Tg测定[8]差示扫描量热仪（DSC）实验条件设定：反应气50mL·min-1的氮气；第一轮升温从25℃以3℃·min-1的速率升至80℃，在80℃平衡10min后以20℃·min-1的速率降温至-10℃，平衡3min后以20℃·min-1的速率再升温至80℃；以外推起始点温度作为Tg。精密称取样品5mg于40µL的铝坩埚中，密封后放在DSC进样器中，以设定的升降温速率检测，记录图谱，每个样品平行测定3份。2、结果2.1关键质量属性的表征采用GPC、1HNMR、GPC-3D、DSC分别测定了5种12个不同规格的多肽微球注射剂和11种型号PLGA样品的MwR、L∶G与PLGA含量、MwA、g′和B、Tg。结果如表1和表2所示。2.2Tg测定影响因素考察称样量对Tg的影响：DSC测定所用的标准铝坩埚体积为40µL，分别称取5、10、15、20mg的注射用醋酸亮丙瑞林微球（11.25mg）研究称样量对Tg的影响，结果如图2所示。从图2可以看出，称样量越大，玻璃化转变越明显。注射用醋酸亮丙瑞林微球（11.25mg规格）的Tg值会随着称样量的增加而增大，当称样量在10mg以下时，测得的值在45℃左右；当称样量大于15mg时，测得的值在48℃左右；10mg以下称样量和15mg以上称样量的单次测量与表2中5mg称样量平行3次测得的47.15℃相差分别在3℃和1℃以内，说明5mg称样量的3次平行测定结果的准确度便可满足大部分微球样品的Tg测量；样品Tg值受称样量影响，也受标准坩埚的体积限制（约10mg），建议每次称取10mg样品。表1微球注射剂中载体辅料关键质量属性的检测结果变温速率对Tg的影响：DSC测定聚合物Tg一般包括3个步骤，首先以一定速率从室温开始加热到足够高的温度，使样品形成均匀的共溶液以消除实验材料以前的热历史，随后快速降温至比预期Tg低约50℃，使共溶液转变为冻结态，最后再以一定速率升温至比外推终止温度高约30℃，在这一阶段的DSC曲线上分析Tg[8]。DSC最大可实现升温速率一般不超过30℃·min-1，故选取3、10、20、30℃·min-1研究变温速率对Tg的测定。设DSC的3变温速率（升温-降温-升温）依次为v1、v2和v3，按升降温速率是否一致分成3方法：即升降温速率一致的方法一（M1)(v1=v2=v3）、升降温速率不一致的方法二（M2)(v1=v3,v2=20℃·min-1）和三段变温速率均不一致的方法三（M3)(v1=3℃·min-1,v2=20℃·min-1）。当v3分别取不同值时，称取10mg注射用醋酸亮丙瑞林微球（11.25mg）测试变温速率对其Tg的影响，结果如图3所示。表2多种型号PLGA关键质量属性的检测结果图2注射用醋酸亮丙瑞林微球（11.25mg）测定的DSC曲线（称样量为5、10、15、20mg)图3注射用醋酸亮丙瑞林微球（11.25mg）在M1(A）、M2(B）、M3(C）测定下的DSC曲线从图3可以看出，第二次升温速率越高，样品的玻璃化转变越明显。对两者的g′与其所用方法和时间作图，得到图4。由图4可知，注射用醋酸亮丙瑞林微球（11.25mg）在3种方法测量下的Tg走向大致相同，测得的Tg值均在44.5～48℃之间变化，与表2平行3次测得的47.15℃相差为±2.7℃，在10mg称样量的单次测量误差范围内（±3℃），说明这3方法之间没有明显区别，可以互为替代。图4注射用醋酸亮丙瑞林微球（11.25mg）在各方法下的g′结合文献[9]报道的升降温速率一致时能够得到标准的玻璃化转变曲线，选定升降温速率一致的方法作为样品玻璃化温度的首选方法；考虑到变温速率不同时，对应方法的消耗时间也不同，以提高实验效率为原则，优先选择方法一中耗时相近的v1=v2=v3=20℃·min-1和v1=v2=v3=30℃·min-1作为候选方法，但由于30℃·min-1是DSC最大可实现的升温速率，且DSC最常用的升温速率是20℃·min-1，最终选择v1=v2=v3=20℃·min-1作为多肽微球注射剂玻璃化转变温度的测定方法。3、讨论缓释注射剂发展的难点主要是缺乏对载体辅料分子水平上的全面解析，表征分析载体辅料的关键质量属性对确保该类制剂产品性能的可比性至关重要。PLGA作为多肽缓释注射剂的关键组成部分，使多肽微球注射剂实现了药物释放周期从1周到6个月不等，不同释放周期反映了不同药物释放动力学的差异，这种差异是由制剂中PLGA的相关质量属性及载药量控制的。本文将分析探讨有关分子量、L∶G与含量、g′、Tg等PLGA关键质量属性表征及其作用机理，以及Tg对微球制剂加速释药的影响。3.1多肽微球缓释注射剂中PLGA关键质量参数对比分析多肽微球缓释注射剂中PLGA的特性是由其分子量、L∶G与含量、g′、Tg等关键质量属性所决定的。由表1可见，5种12个不同规格的多肽微球注射剂中PLGA的MwR在1.2～5.3×104Da;L∶G值有7种：50∶50、52∶48、53∶47、55∶45、74∶26、75∶25和100∶0;PLGA含量在55.8%～80.5%;PLGA的g′MwA在0.7～4.5×104Da；奥曲肽微球PLGA的g′值在0.8左右，B值为3.3～3.5，为星型PLGA；其他多肽微球的g′值为0.9～1.0，为线型PLGA；多肽微球注射剂的Tg值在32.1～47.2℃，大部分集中于35～45℃。g′和B测定取决于线型参照品的选择，尽可能选取摩尔比和MwA与待测样品相近的PLGA作为线型参照品[10]，如注射用醋酸曲普瑞林以PLGA5050-3A为参照物，其他线型载体微球以PLGA5050-2.5A为参照物，注射用奥曲肽及PLGA样品均以PLGA5545-AP222为参照物。g′值一般在0～1之间，g′值越小则样品支化度越高，g′值越大则样品的线型越好，g′值大于1表示所测样品的线性比所用线型参照物的线性更好。B值是对非线型样品的支化程度进行量化的参数，线型参照品对应的B值为2,B值越大，代表样品的支化程度越高。由表2可见，PLGA样品的结构有线型、星型及臂型：线型PLGA的g′值为0.9～1.0，星型PLGA的g′值为0.8,B值为3.5；臂型PLGA的g′值在0.6～0.8之间变化，且随着B的增多而减小；B值在2.5～5.7之间变化，且随着B的增多而增大。为了进一步探讨多肽微球注射剂中PLGA的Tg与分子量、L∶G值、含量、g′值的关系，选取表1和表2中具有代表性的微球注射剂和纯PLGA样品对其Tg作图，图中用样品编号代表不同的PLGA和微球，结果如图5所示。图5-A中的样品是L∶G为50∶50的线型PLGA，可以看出PLGA的Tg随着其分子量的增加而增大。图5-B中的样品是L∶G约为50∶50的线型PLGA微球，可以看出随着微球中PLGA含量的增加，微球的Tg也会随之增加，其分子量的走势表明微球的Tg不仅受分子量的影响，还受PLGA含量的影响，且含量的影响较大。图5-C中样品是不同摩尔比的微球，可以看出随着微球中PLGA的L∶G值的增加，微球的Tg也会随之增加；对于L∶G值相近的线型微球，PLGA含量与分子量增加，微球的Tg也会随之增加。图5-D）中样品是非线型PLGA与微球，可以看出，PLGA的Tg值与其结构之间有一定的关系。对于多臂型PLGA来说，其Tg值随支化度或臂数的变化呈现2趋势：当g′值在0.7～1.0或B值在2.0～4.0时，Tg会随着g′值的减小或B值的增加而增大；当g′值小于0.7或B值大于4.0时，会随着值的减小或B值的增加而减小。样品6、7、8是目前唯一使用星型PLGA作为载体辅料的奥曲肽微球[11]，与样品22（星型PLGA）的g′、B及L∶G值近似相，但奥曲肽微球的g′值较低，因为其PLGA相对分子质量与含量均低于星型PLGA。图5多肽微球的Tg值与其PLGA关键质量属性的关系综上结果表明，L∶G值越高（LA含量高），Tg也越高；L∶G相同的微球，PLGA含量低则Tg低；而L∶G相近的非线型PLGA微球的Tg值小于线型PLGA微球；PLGAL∶G和含量较高的微球，其Tg值明显高于其他微球，L∶G对微球Tg值的影响大于分子量的影响。3.2多肽微球缓释注射剂中PLGA关键质量属性及其作用机理PLGA是由不同比例的丙交酯丙交酯和乙交酯组成的共聚物，在人体内能够降解成丙交酯和乙交酯分子。PLGA组成对微球降解动力学和溶解性能起着非常重要的作用，PLGA中L∶G的比值和PLGA分子量是调节药物递送系统中药物释放和聚合物降解的最关键的2个参数。通过调节PLGA2种单体的比例、MwR和粘度等物理化学性质来影响PLGA微球在体内的降解速率，进而影响缓释注射剂的释药周期等，最终实现以可控的方式使所载药物达到持续长效释放的目的。高分子Tg是关联其结构与性能的重要参数，玻璃化转变取决于聚合物的自由体积[12,13]。线型PLGA微球，其Tg值主要与链间相互作用和分子量相关，MwR越大，其链末端的自由体积就越少，所需玻璃化转变的能量就越高，所以Tg随分子量的增加而增大；LA含量越高，Tg值也越大，推测是由于LA的自由体积比GA小，且LA比GA更稳定的缘故；L∶G对Tg值的影响大于分子量的影响，推测是由于LA造成的自由体积的减少比MwR的大得多；PLGA含量越高，则链间的相互作用越大，导致链端与链间的自由体积减小，Tg值也越高。对于非线型载体的微球制剂，其g′越小，即B越高，自由体积就会越少，故Tg值在某一范围内随着B的增加而增大，当自由体积因B的增加而减少到一个极限时，分子又会由于发生链缠结而导致自由体积增大，Tg值也随之减小。3.3多肽微球缓释注射剂中PLGATg对释药速率的影响PLGA的玻璃化转变发生在一个相当明确的温度下，发生玻璃化转变时，其热膨胀系数、热容量、折射率等也会随之改变，从而间接影响PLGA的降解速率[14]。判断PLGA从开始降解到完全降解的主要指标是介质温度达到Tg时所需要的时间。设置介质温度在Tg附近，PLGA完全降解所需时间就短，微球中药物释放就快。微球中PLGA的Tg值会随分子量[15]、L∶G值[16]、PLGA含量与g′的增加而增大，达到某一极值后可能会趋于平稳，也可能会下降；在同等或相似条件下，L∶G与PLGA含量对Tg的影响大于分子量的影响。利用这些相互作用的关系可以实现对已知分子量、L∶G或PLGA含量的微球进行Tg的预测：如L∶G约为50∶50、PLGA含量小于60%的微球，其Tg在32～36℃；L∶G约为50∶50、PLGA含量大于60%的微球，其Tg在38～42℃；L∶G大于75∶25的微球，其Tg在45～47℃。为了快速评价多肽微球注射剂的体外释放情况及其产品批间的一致性，需研究开发必要的体外加速释放度试验方法。以注射用醋酸奥曲肽微球为例，其临床给药周期为28d，在体外加速释放试验温度选择时，参考L∶G约为50∶50、PLGA含量大于60%的微球，其Tg在38～42℃，选择低于、高于此范围的温度，考察温度对微球药物加速释放的影响。如图6所示，温度高于其Tg范围时，如45、55℃的条件下，4h内微球中奥曲肽释放较慢，推测是由于释放介质温度高于Tg上限，使微球中的PLGA由玻璃态快速转变为高弹态，这种形态变化闭合了表面孔隙，从而减少了药物的扩散；4h后在55℃的条件下，微球药物突然释放加快，推测是由于更高的温度使PLGA显现溶蚀作用，导致药物加快释放[17,18]；而在45℃的条件下，微球PLGA的高弹态减慢了药物释放；释放介质温度选择低于Tg下限的37℃条件下，微球中奥曲肽释放平稳且24h释放量超过60%。由此可见，选择略低于微球Tg范围下限的温度作为醋酸奥曲肽的体外加速释放试验的温度比较合适。图6醋酸奥曲肽微球在不同温度的释放度曲线通常的研发实践中，不管什么类型的PLGA，希望选择Tg约为37℃，或比37℃稍高一些的微球，过低Tg的微球进入体内，会变得太软，释放行为发生变化；过高Tg的微球太硬，不利于药物从微球中扩散释放。4、小结多肽微球注射剂中PLGA分子量、摩尔比、含量、g′和Tg是影响制剂有效性的关键因素。这些参数是评估生产工艺、调整载药浓度以及终产品快速质量控制的基础。本文优化了多肽微球注射剂中载体辅料PLGA的关键质量属性表征方法，研究了称样量和DSC变温速率对玻璃化转变温度的影响，建立了多肽微球注射剂Tg的测定方法；检测分析了多种规格多肽微球注射剂中PLGA分子量、L∶G值、PLGA含量、g′和Tg；探讨了PLGA的5个属性之间的关系与作用机理及其对微球制剂药物释放的影响，为多肽微球注射剂Tg范围的预测奠定基础。然而Tg只是1个表观指标，受PLGA的分子量、L∶G值等的影响，不是影响释药的决定因素，与多肽微球释药相关的内在因素是PLGA的分子量、L∶G值、g′等。本文可为多肽微球缓释注射剂中PLGA全面表征及其内在质量的对比研究，为企业合理使用载体辅料及体外释放度加速试验方法的研究提供参考，对多肽微球缓释注射剂的质量控制与药学一致性评价研究也具有参考作用。参考文献：[1]王玉静,孙秀芝,徐丽,等.微球制剂的研究进展及前景分析[J].生物化工,2017(2):80[2]何广宏,万丹丹,董然.长效微球注射剂的研究进展[J].中国医院药学杂志,2015,35(10):963[3]李勋,韦祎,马光辉,等.缓释微球制剂的研究进展[J].北京化工大学学报(自然科学版),2017,44(6):1[8]王洪亮,汪仁芸,刘玉玲.胸腺五肽长效微球玻璃化温度测定及释放度加速试验方法的研究[C].2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集,2006:257[9]徐颖,张勇.测量玻璃化转变温度的几种热分析技术[J].分析儀器,2010(3):57[12]卢新亚,姜炳政.高聚物玻璃化转变温度和分子参数的关系I.高聚物链柔性与Tg的关系[J].高分子学报,1990,1(4):434[14]张伊洁,郭宁子,刘万卉,等.缓控释注射剂中丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)分析方法的研究进展[J].中国医药工业杂志,2019,50(10):1180张伊洁,郭宁子,许丽晓,庾莉菊,孙悦,冯玉飞,张霞,宋新力,刘万卉,杨化新,何兰.多肽微球缓释注射剂中载体辅料丙交酯乙交酯共聚物的关键质量属性分析[J].药物分析杂志,2020,40(06):988-998基金:国家重大新药创制科技重大专项(2017ZX09101001-007)。