探讨视网膜母细胞瘤Y-79细胞生长转移能力及信号传导及转录激活因子3的靶向作用与miR-590-5p的关系.docx

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探讨视网膜母细胞瘤Y-79细胞生长、转移能力及信号传导及转录激活因子3的靶向作用与miR-590-5p的关系视网膜母细胞瘤是一种最常见的眼内恶性肿瘤，常发生在儿童时期[1]，在发展中国家有较高的死亡率[2]。尽管近年来对RB的发病机制有了更深的了解，且在治疗上取得了巨大的进步，但由于缺乏早期诊断以及癌细胞转移，生存率仍较低[3]。因此，寻找更为灵敏的靶向标志物以及能有效抑制肿瘤细胞转移的治疗方法是目前RB治疗研究的重点。microRNA是一类长度约22nt的小分子非编码RNA，可通过与目标基因mRNA的3′UTR区域结合，对目标基因起沉默作用[4]。miRNA在正常细胞内参与各种进程，包括增殖与发育、凋亡和胁迫反应等。在癌症中，很多miRNA均发生了异常表达，对肿瘤发生机制起着不同的作用[5,6]。已有多种miRNA被发现与RB的发生、发展密切相关[7]。因此，miRNA在作为癌症的诊断标志物和靶向药物方面具有巨大的潜力。以往研究发现，miR-590-5p在多种癌症中发挥着不同的调控作用，有研究表明，miR-590-5p可靶向调控信号传导及转录激活因子3(signaltransducersandactivatorsoftranscription3,STAT3），抑制骨肉瘤143B细胞的迁移和侵袭[8],STAT3已被报道在RB的发生中起重要作用[9]，推测miR-590-5p可能在RB中通过调控STAT3的表达影响RB的增殖、凋亡和转移能力。为了证实这一猜想，本研究培养人源RB细胞，转染miR-590-5pmimic和STAT3过表达载体，初步探讨miR-590-5p与STAT3的相互作用及其对RB生长和转移能力的影响。1、材料与方法1.1临床样本收集2012～2017年存档于西安交通大学第二附属医院经病理学检查确诊为RB的石蜡包埋组织块及癌旁组织各20份，其中RB样本男12份，女8份，年龄1～4岁，平均1.8岁；癌旁组织样本男9份，女11份，年龄1～4岁，平均2.1岁。各组入选者性别和年龄差异均无统计学意义（P>0.05），所有样本获取均取得患者或家属知情同意，本研究获得本院伦理委员会批准。1.2细胞、质粒及miRNA人正常视网膜细胞株HREC、RB细胞株Y-79和SO-RB50购自ATCC;miR-590-5pmimic、阴性对照miRNA(miR-NC）和质粒pcDNA3.1-STAT3(pc-STAT3）购自上海吉玛制药技术有限公司。1.3主要试剂及仪器胎牛血清和RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；青霉素、链霉素、Trizol试剂、RIPA裂解液、BCA试剂盒、ECL显色液和CCK-8试剂均购自北京索莱宝生物科技有限公司；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；Lipofectamine2000购自上海吉玛制药技术有限公司；反转录试剂盒QuantNovaSYBRGreenPCR购自德国Qiagen公司；STAT3、GAPDH、增殖蛋白Ki67、活化半胱天冬酶-3、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9鼠抗人单抗购自美国SantaCruz公司；pRL-CMV荧光素酶报告载体和双荧光素酶报告检测系统购自美国Promega公司。1.4细胞培养用体积分数为10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/L链霉素的RPMI1640培养基，于37℃，5%CO2环境中培养Y-79和SO-RB50细胞。1.5RB组织及细胞中miR-590-5p、STAT3基因转录水平的检测采用RT-PCR法检测RB组织中miR-590-5p、STAT3基因转录水平及Y-79和SO-RB50细胞中miR-590-5p基因转录水平。用Trizol试剂提取各组织和细胞RNA，反转录合成cDNA，以其为模板，PCR扩增miR-590-5p、STAT3基因。引物由Primer3Input设计，miR-590-5p引物序列为：5′-GAGCTTATTCATAAAAGTGCAG-3′；STAT3上游引物序列为：5′-GCCGGAGAAACAGGATGGCCCAA-3′，下游引物序列为：5′-CTGCCGCAGCTCCATTGGGAA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应扩增条件为：95℃预变性2min;95℃变性5s,60℃退火延伸10s，共40个循环。根据QuantNovaSYBRGreenPCRkit说明书检测mRNA或miRNA水平，通过2-△△Ct法进行计算。并分析STAT3与miR-590-5p基因转录水平的相关性。1.6细胞分组及处理将Y-79细胞分为Y-79、miR-NC、miR-590-5pmimic、miR-590-5pmimic+pc-STAT3组，Y-79组不经任何处理正常培养，另3组按照Lipofectamine2000说明书分别转染对应的miRNA和质粒，24h后，RT-PCR检测细胞中miR-590-5p和STAT3基因的转录水平。1.7miR-590-5p与STAT3靶向作用关系的检测通过Targetscan预测miR-590-5p与STAT3的靶向结合位点，构建STAT3Lenti-reporter-luciferase野生型（STAT3WT）和突变型（STAT3MUT）载体。将细胞分为STAT3WT和STAT3MUT组，24孔板培养1d，将STAT3WT载体与Prl-CMV载体共转染STAT3WT组细胞，STAT3MUT载体与Prl-CMV载体共转染STAT3MUT组细胞，进一步将细胞分为STAT3WT+miR-NC、STAT3WT+miR-590-5pmimic、STAT3MUT+miR-NC、STAT3MUT+miR-590-5pmimic组，按照与组名对应的方式进行转染，48h后通过荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。1.8蛋白表达水平的检测采用Westernblot法。用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒定量，每组取30μg蛋白，经10%SDS-PAGE分离后，半干转膜法转膜，以50g/L脱脂牛奶室温封闭2h；加入1∶1000稀释的一抗，4℃孵育过夜；PBS清洗3次，加入HRP标记的兔抗鼠二抗（1∶2000稀释），孵育2h；加入ECL显色液曝光显影。1.9细胞增殖的检测采用CCK-8法。将细胞接种于96孔板中，置于5%CO2,37℃培养箱中培养，每隔1d使用CCK-8试剂检测细胞增殖倍数：每孔加入10μLCCK-8试剂，继续培养4h,450nm波长处检测吸光度值。持续检测3d。1.10细胞凋亡的检测采用流式细胞术。每组细胞中加入150μLbindingbuffer和5μLAnnexin-V-FITC，混匀，暗室室温孵育15min，加入100μLbindingbuffer和5μLPI，混匀，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。1.11统计学分析利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，Spearman相关分析比较miR-590-5p与STAT3基因转录水平的相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。2、结果2.1RB组织及细胞中miR-590-5p基因的转录水平RB组织中miR-590-5p基因的转录水平显著低于普通视网膜组织，且差异有统计学意义（t=6.458,P=0.000），见图1;SO-RB50和Y-79细胞株中miR-590-5p基因的转录水平均显著低于视网膜内皮细胞株HREC，且差异均有统计学意义（F=904.4,P=0.000），见图2。表明在RB组织和细胞株中miR-590-5p基因的转录水平下降。2.2RB组织中STAT3基因的转录水平及其与miR-590-5p基因转录水平的相关性RB组织中STAT3基因的转录水平显著高于普通视网膜组织，且差异有统计学意义（t=10.20,P=0.000），见图3。相关性分析表明，STAT3基因的转录水平与miR-590-5p基因的转录水平呈负相关性（r=-0.8835,P=0.000），见图4。图1各组织中miR-590-5p基因的转录水平注：aa表示P<0.01。图2各细胞中miR-590-5p基因的转录水平注：aa表示与正常视网膜细胞株HREC相比，P<0.01。图3各组织中STAT3基因的转录水平注：aa表示P<0.01。图4miR-590-5p和STAT3基因转录水平的相关性分析2.3miR-590-5p对STAT3基因转录的影响转染后24h，与Y-79组相比，miR-NC组miR-590-5p和STAT3基因的转录水平差异均无统计学意义（P>0.05);miR-590-5pmimic组miR-590-5p基因的转录水平显著升高（P<0.01），表明miR-590-5p转染成功；STAT3基因转录水平显著降低（P<0.01），表明miR-590-5p可抑制STAT3基因的转录。其中miR-590-5p基因转录水平比较，F=414.2,P=0.000;STAT3基因转录水平比较，F=168.4,P=0.000。见图5。图5Y-79细胞中miR-590-5p对STAT3基因转录的影响（n=6)A:miR-590-5p基因转录水平；B:STAT3基因转录水平。注：aa表示与Y-79组比较，P<0.01。2.4miR-590-5p与STAT3的靶向作用关系通过Targetscan预测miR-590-5p与STAT3的靶向位点见图6。STAT3WT+miR-590-5pmimic组的荧光素酶活性显著低于STAT3WT+miR-NC组，且差异有统计学意义（t=16.91,P=0.000);STAT3MUT+miR-NC与STAT3MUT+miR-590-5pmimic组比较，差异无统计学意义（t=0.1924,P>0.05），见图7。表明miR-590-5p与STAT3存在靶向作用。图6Targetscan预测miR-590-5p与STAT3的靶向位点图7荧光素酶报告基因系统检测miR-590-5p与STAT3的靶向作用关系（n=6)注：aa表示与STAT3WT+miR-NC组比较，P<0.01。2.5miR-590-5p对Y-79细胞中STAT3蛋白表达的影响miR-590-5pmimic组细胞中STAT3蛋白的表达水平显著低于miR-NC组，且差异有统计学意义（F=112.4,P=0.000);miR-590-5pmimic+STAT3组显著高于miR-590-5pmimic组，且差异有统计学意义（F=112.4,P=0.000）。见图8和图9。表明miR-590-5p抑制了Y-79细胞中STAT3蛋白的表达。图8Westernblot分析各组Y-79细胞中STAT3蛋白的表达水平图9各组Y-79细胞中STAT3蛋白的表达水平（n=6)注：aa表示与miR-NC组比较，P<0.01;bb表示与miR-590-5pmimic组比较，P<0.01。2.6STAT3过表达对miR-590-5p对Y-79细胞增殖和凋亡调控作用的影响miR-590-5pmimic组中细胞增殖水平显著低于miR-NC组，细胞凋亡率显著高于miR-NC组，且差异均有统计学意义（P=0.000);miR-590-5pmimic+STAT3组细胞增殖水平显著高于miR-590-5pmimic组，细胞凋亡率显著低于miR-590-5pmimic组，且差异均有统计学意义（P=0.000）。见图10～12。表明miR-590-5p可抑制Y-79细胞增殖（F=66.91,P=0.000），并促进细胞凋亡（F=170.7,P=0.000),STAT3过表达可扭转miR-590-5p的作用。2.7STAT3过表达对miR-590-5p对Y-79细胞生长和转移相关蛋白调控作用的影响miR-590-5pmimic组Y-79细胞Ki67、VEGF、MMP-9蛋白的表达水平显著低于miR-NC组，cl-caspase-3蛋白的表达水平显著高于miR-NC组，且差异均有统计学意义（P=0.000);miR-590-5pmimic+STAT3组Ki67、VEGF、MMP-9蛋白的表达水平显著高于miR-590-5pmimic组，cl-caspase-3蛋白的表达水平显著低于miR-590-5pmimic组，且差异均有统计学意义（P=0.000）。见图13和图14。表明miR-590-5p可抑制细胞增殖标志蛋白Ki67表达（F=165.8,P=0.000），促进凋亡标志蛋白cl-caspase-3表达（F=270.0,P=0.000），同时可抑制转移相关蛋白VEGF(F=199.2,P=0.000）和MMP-9(F=311.9,P=0.000）表达；STAT3过表达可扭转miR-590-5p的调控作用。图10各组Y-79细胞的增殖水平（n=6)注：aa表示与miR-NC组比较，P<0.01;bb表示与miR-590-5pmimic组比较，P<0.01。图11各组Y-79细胞的调亡率（n=6)注：aa表示与miR-NC组比较，P<0.01;bb表示与miR-590-5pmimic组比较，P<0.01。图12流式细胞术检测各组Y-79细胞的调亡率图13Westernblot法检测各组Y-79细胞生长和转移相关蛋白的表达水平图14各组Y-79细胞生长和转移相关蛋白的表达水平（n=6)注：aa表示与miR-NC组比较，P<0.01;bb表示与miR-590-5pmimic组比较，P<0.01。3、讨论STATs家族由7个高度同源的蛋白组成，具有将信号从细胞因子受体传导进入细胞核内的作用。其中STAT3是STATs家族中最普遍的成员，对很大范围内的细胞因子和生长因子的信号均具有传导作用，在炎症、糖酵解、免疫抑制中起重要的生理作用[10]。STAT3在为数众多的肿瘤及肿瘤来源的细胞株中均出现高表达，因此被认为是一种致癌基因，常被作为抗癌治疗的靶点[11,12]。尽管有研究表明，STAT3在某些条件下也具有肿瘤抑制的作用[13,14]，但在RB的研究中，STAT3表现出明确的促癌作用：LIU等[15]通过将miR-29a靶向作用于STAT3，抑制了人RB的增殖；JO等[16]使用STAT3抑制剂下调STAT3/miR-17-92簇的正反馈，从而抑制了RB的增殖。本实验室前期研究预测了miR-590-5p和STAT3可能存在靶向作用关系。同时，许国泰等[8]报道了miR-590-5p可通过靶向作用于STAT3，抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移。推测在RB中，miR-590-5p同样可通过靶向作用STAT3调控肿瘤细胞的生长和转移。为了证实该推测，本研究首先通过临床获取的RB组织样本及癌旁组织样本，检测了miR-590-5p与STAT3基因转录水平的相关性，发现在RB组织中miR-590-5p水平显著降低，STAT3mRNA水平显著升高，Spearman相关分析表明，miR-590-5p与STAT3基因转录水平具有良好的负相关性。在细胞实验中发现，miR-590-5p可显著抑制STAT3基因的转录，与临床样本的研究结果一致。进一步通过荧光素酶报告基因检测证实了miR-590-5p与STAT3存在靶向作用关系，且miR-590-5p可显著抑制STAT3蛋白的表达，STAT3过表达载体可逆转miR-590-5p对STAT3蛋白表达的抑制作用。上述研究结果表明，miR-590-5p可通过靶向作用于STAT3基因，沉默STAT3的表达。促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡是STAT3促癌的重要机制之一。STAT3可通过调控多个下游基因，如细胞周期蛋白D1(CyclinD1）、凋亡抑制基因Survivin、B淋巴细胞瘤xL(B-celllymphoma-xL,BclxL）、Bcl-2等，促进细胞增殖，并抑制细胞凋亡[17]。近期研究表明，在RB组织中STAT3表达量显著增加，敲除STAT3可抑制细胞增殖并抑制肿瘤生长[16]。为了探究miR-590-5p靶向STAT3基因对RB生长的调控作用，本研究对RB细胞的增殖和凋亡水平进行检测，发现miR-590-5p可显著抑制RB细胞的增殖，并促进细胞凋亡，STAT3过表达可逆转miR-590-5p对RB细胞的作用。进一步研究发现，miR-590-5p可显著降低Ki67的表达，并促进cl-caspase-3的表达，STAT3过表达可逆转该过程。Ki67是一种细胞增殖的标志物，其存在于细胞周期的各个阶段，在休止期表达量很少[18];Caspase-3是Caspase家族最重要的执行因子，直接参与关键细胞蛋白的降解，大部分细胞凋亡程序最终均需激活Caspase-3，才能引起细胞凋亡[19]。结合本实验结果表明，miR-590-5p可通过下调STAT3表达，进而抑制RB细胞增殖，并促进其凋亡。促进肿瘤细胞的转移是STAT3促癌的又一重要机制。VEGF和MMP-9均为STAT3下游调控的关键基因[20]。VEGF能促进血管内皮细胞增生形成新生血管，在肿瘤中可诱导肿瘤血管增生，并促进肿瘤细胞转移[21];MMP-9是分解细胞外基质的主要酶类，通过降解细胞外基质，可促进瘤细胞向周围组织中浸润[22]。本研究发现，miR-590-5p可显著抑制RB细胞中VEGF和MMP-9表达，STAT3过表达可拮抗miR-590-5p的作用，提高VEGF和MMP-9的表达水平，表明miR-590-5p可通过作用于STAT3，抑制肿瘤血管生成和细胞外基质降解，从而抑制RB细胞对周围组织的浸润和转移。综上所述，miR-590-5p可通过靶向作用于STAT3基因，沉默STAT3的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，并促进细胞凋亡，抑制VEGF和MMP-9的表达，进而抑制肿瘤血管生成和细胞外基质降解，阻止肿瘤细胞的转移。本研究初步探讨了miR-590-5p通过靶向作用于STAT3基因，对RB生长和转移的影响，以期为RB治疗提供具有潜力的药物。后期将重点对miR-590-5p对STAT3相关信号通路方面的作用及机制开展进一步的研究。参考文献：[8]许国泰,周姣丽,郭胜,等.miR-590-5p靶向调控STAT3基因对骨肉瘤143B细胞迁移和侵袭的影响[J].蚌埠医学院学报,2017,42(9):1165-1169.[19]白建伟,李岩,王峰,等.绿原酸调控胃癌SGC-7901细胞Bax和Caspase-3蛋白诱导细胞凋亡的作用[J].医学分子生物学杂志,2018,15(3):131-135.(inChinese)[20]余仔军,侯和磊,张晓春.靶向VEGF/VEGFR通路治疗胃癌的研究进展[J].临床肿瘤学杂志,2016,21(6):564-568.[22]周景芬,李秀娟.α-硫辛酸对兔动脉粥样硬化斑块CD147及基质金属蛋白酶的表达的影响[J].医学分子生物学杂志,2017,14(3):147-151.刘青,宁超,杨捷玲,岳小丁.miR-590-5p与信号传导及转录激活因子3的靶向作用关系及其对视网膜母细胞瘤Y-79细胞生长和转移能力的影响[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):640-647.基金:陕西省自然科学基础研究计划(2017JQ8048).