青霉素对血小板活性寿命及黏附相关功能的影响.docx

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青霉素对血小板活性、寿命及黏附相关功能的影响外伤和异物植入易引起机体组织损伤和出血，在凝血酶等刺激作用下，血小板可快速到达出血部位，通过改变形状和表达受体启动快速止血凝血反应[1]。血小板作为血液中一种特殊的成分，不仅具有止血功能，在介导非特异性反应、炎症反应、组织修复以及宿主防御等方面也具有重要作用[2]。既往研究发现，血小板在循环血液中的寿命只有8～9d，体外储存血小板的功能会在5d之内基本丧失，在感染、糖尿病、肿瘤和原发性血小板减少性紫癜等疾病中会出现血小板寿命缩短而被提前清除，继而影响血小板正常生理功能[3,4]。因此，有关血小板寿命调控机制的相关研究尤为重要。药源性血小板减少症是指药物导致机体血小板计数低于正常范围，引发机体出血不止等症状。研究发现，精神神经系统药物、抗菌药物、抗凝抗血小板药物以及抗肿瘤药物等均会引起药源性血小板减少症[5]。相关研究也证实了抗菌类药物，如青霉素类、头孢菌素类药物等会导致血小板减少，使血小板凝集功能减退[6]。药源性血小板减少引起的凝血障碍是临床抗生素用药的不良反应，本研究采用常用β-内酰胺类抗生素药物代表之一青霉素处理小鼠外周血小板，探讨青霉素对血小板活性、寿命、激活及黏附相关功能的影响，以期为抗生素的临床使用提供基础资料。1、材料1.1实验动物20只雄性C57BL/6J小鼠，22～23g,8周龄，购自华中农业大学，实验动物生产许可证SCXK（鄂）2015-0019。1.2药物及主要试剂青霉素（货号P0389），购自美国Sigma公司；MTT检测试剂盒（货号G020-1、规格500T），购自南京建成生物工程研究所；蛋白激酶A(ProteinkinaseA,PKA)ELISA检测试剂盒（货号MU30643、规格48T）、β血小板球蛋白（β-thromboglobulin，β-TG)ELISA检测试剂盒（货号MU30686、规格48T）、超氧化物歧化酶2(Superoxidedismutase2,SOD2)ELISA检测试剂盒（货号MU30941、规格48T）、血小板第4因子（Plateletfactor4,PF4)ELISA检测试剂盒（货号MU30619、规格48T）、血小板内皮细胞黏附分子-1(Plateletendothelialcelladhesionmolecule-1,PECAM-1)ELISA检测试剂盒（货号MU30828、规格48T）、磷酸缓冲盐溶液（Phosphatebuffersaline,PBS）（货号PAB180003），购自武汉华联科生物技术有限公司；小鼠外周血血小板分离液试剂盒（货号PLA2011M），购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；台式缓冲液（Tyrode’sbuffer）（货号BCZ0061），购自BioRike博瑞克公司。2、方法2.1小鼠外周血小板的分离使用2%戊巴比妥钠（25mg/kg）麻醉C57BL/6J小鼠，打开小鼠腹腔暴露腹主动脉，使用含100µLACD缓冲液的2mL注射器在腹主动脉取血900μL，将血液转移到15mL离心管中，加入1.5倍体积的PBS将其与血液混匀，200×g离心8min，吸取离心后上层富血小板血浆（Platelet-richplasma,PRP）至新离心管中。剩余的下层血液中再加入约2mLPBS将其混匀，200×g离心5min，吸取离心后的上层PRP，将两次离心所得PRP合并，700×g离心10min，弃去上清，下层即为血小板，使用1×Tyrode’sbuffer洗涤血小板2次，用于后续实验。2.2血小板活性检测实验组和对照组样本均采用MTT法检测不同浓度青霉素对血小板活性的影响。根据Lescano(2018）的实验步骤进行MTT测定[7]，将新鲜分离的血小板使用1×Tyrode’sbuffer洗涤2次后，以1.5×108/mL浓度与不同浓度青霉素（10、50、100、500、1000、5000U/mL）或PBS（对照组）在96孔板上一起孵育24h。孵育完成后，将血小板与5mg/mLMTT溶液在CO2培养箱中孵育3h。然后除去MTT染料，向孔中加入100μL溶解溶液（酸化的10%SDS），使用酶标仪在540nm处测量吸光度（A）值。2.3PKA、β-TG、SOD2、PF4和PECAM-1含量检测收集与半数抑制浓度（985.68U/mL）青霉素孵育24h后的血小板，置于冰盒中，使用超声裂解仪裂解，超声5s停止5s，共10次后，取血小板裂解液上清。试剂盒法检测PKA、β-TG、SOD2、PF4和PECAM-1含量。2.4统计学分析采用统计学软件SPSS22.0进行数据分析，实验数据采用表示，两组间比较采用t检验。3、结果3.1血小板存活率血小板存活率结果如图1所示，随着青霉素浓度的增大，血小板数目逐渐减少，血小板存活率逐渐降低。青霉素作用24h的IC50值为985.68U/mL。3.2青霉素对血小板寿命相关蛋白PKA和SOD2含量的影响与对照组比较，青霉素组的PKA和SOD2的含量显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。3.3青霉素对血小板释放功能相关蛋白β-TG和PF4含量的影响与对照组比较，青霉素组的β-TG和PF4含量均显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。图1不同浓度青霉素对血小板活性的影响表1青霉素对血小板PKA和SOD2含量的影响与对照组比较：*P<0.05表2ELISA检测青霉素对血小板β-TG和PF4含量的影响与对照组比较：*P<0.05 3.4青霉素对血小板黏附功能相关蛋白PECAM-1含量的影响青霉素组的PECAM-1含量显著低于对照组，其差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见图2。4、讨论药源性血小板减少症无明显的临床症状，病情一般都较为轻微，少数可能会导致消化道甚至颅内出血等严重症状，如未及时发现或处理将严重危害患者的生命安全[8]。引起药源性血小板减少的药物种类较多，据统计抗感染药物所占比例最大[9]。当机体发生感染性疾病时，一般会采用抗菌药物进行治疗，然而研究发现在抗生素特别是青霉素类抗生素大量使用后机体可能出现出血时间延长、血小板凝集机能降低，甚至出现药源性血小板减少症[6]。抗菌药物导致血小板减少症状一般具有剂量相关性，随着使用剂量越大，血药浓度越高，症状发生概率越大[10]。抗生素引起药源性血小板减少的机制尚不明确，本次研究用不同浓度青霉素处理血小板，检测血小板中β-TG、PF4、PECAM-1、PKA和SOD2含量变化，初步探讨青霉素引发药源性血小板减少症的可能机制。图2ELISA检测青霉素对血小板PECAM-1含量的影响PKA在血小板信号转导、黏附、聚集以及释放等多种生理功能中发挥着重要的调控作用，血小板内一定量的PKA活性可维持血小板循环稳定[14]。已有研究表明，在血小板缺乏症、糖尿病及细菌感染患者体内发现PKA活性低下且受到抑制，且动物实验研究发现，抑制PKA活性或敲除PKA蛋白会导致血小板功能丧失以及促进血小板凋亡，致使血小板数目急剧下降。SOD2为PKA下游蛋白，参与细胞寿命的调控，且PKA活性与SOD2正相关[15]。闫荣和戴克胜[15]的研究表明抑制血小板中PKA活性可降低血小板聚集功能。本研究结果表明经青霉素处理的血小板中PKA和SOD2的含量显著降低，推测青霉素可能通过抑制PKA/SOD2表达，进而减少血小板数量、降低血小板聚集能力。β-TG和PF4是由血小板α颗粒所释放的两种特异性蛋白质，可以随着血小板的激活而被释放到血液中，可作为体内血小板激活的特异性指标，其含量增高反映了血小板聚集性增强[11,12]。PECAM-1，又名CD31，是一种跨膜糖蛋白，属黏附分子免疫球蛋白超家族的成员，是血小板上唯一的一种细胞黏附分子，已有研究证明其能够参与调控血小板的黏附、聚集等多种功能[13]。本研究结果表明，青霉素可显著降低血小板内β-TG、PF4和PECAM-1的含量，进一步验证了青霉素对血小板活性及其聚集功能的抑制作用。本次研究结果提示，青霉素可显著降低血小板的存活率，抑制血小板活性及聚集功能，其机制可能与降低PKA、SOD2、β-TG、PF4和PECAM-1含量有关，具体的作用机制还需进一步深入研究。通过对β-内酰胺抗生素代表药物之一青霉素对血小板活性和功能的抑制作用的研究，旨在呼吁临床医药人员加强对抗菌药物使用的规范化，定期对抗菌药物使用患者进行血常规检查，强化监测过程，早发现早干预，从而减少因抗生素大剂量使用对血液系统的不良影响。参考文献：[5]秦伟,王晓雪,杜雯雯,等.药源性血小板减少症的研究进展[J].中国医院用药评价与分析,2017,17(5):577-580.[6]赵娟,杨远荣.抗菌药物致血小板减少文献分析[J].现代药物与临床,2017,32(10):2025-2030.[8]杨九一,顾健.药源性血小板减少症机制研究进展[J].中国医院药学杂志,2013,33(22):1874-1877.[9]唐巧云,黄丽,罗圣平,等.264例药源性血小板减少症分析[J].中国药物应用与监测,2017,14(1):41-44.[10]司继刚.抗菌药物致凝血障碍原因分析与对策[J].医药导报,2015,34(6):758-761.[13]杨颖,罗晖.血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)的研究与疾病[J].川北医学院学报,2008,23(6):627-631.[16]闫荣,戴克胜.蛋白激酶A抑制剂对血小板膜糖蛋白Ⅰbα表达及血小板功能的影响[J].中华血液学杂志,2009,30(3):171-174.刘淼,庞花艳,龚菲,姜姗,张黎,彭黎,干银弟.体外研究青霉素对小鼠外周血小板活性与功能的影响[J].药物评价研究,2020,43(09):1758-1761.