预测真武汤治疗慢性心力衰竭的作用机制慢性心力衰竭是由于各种原因造成心肌损伤或心脏结构改变、功能缺失,心室收缩射血和(或)舒张充盈功能发生障碍,从而导致心排血量减少,重要器官、组织灌注不足,出现肺循环和体循环淤血的一组临床综合征[1,2]。2003年的流行病学调查显示,我国80岁以上患病人群高达10%,65岁及以上患病人群高达7%,35～47岁成年人患有心力衰竭的比例为0.9%,CHF已经成为我国乃至世界心脏病防治体系的突出难题[3,4]。真武汤是温阳利水的代表方,此方剂最早出自《伤寒论》,第82条原文中说道:“太阳病,发汗,汗出不解,其人仍发热,心下悸,头眩,身动,振振欲擗地者,真武汤主之。”少阴病篇第316条中也有相关论述:“少阴病二三日不已,至四五日,腹痛,小便不利,四肢沉重疼痛,自下利者,此为有水气。其人或咳,或小便利,或下利,或呕者,真武汤主之。”其病机多为少阴阳虚气化不利以致水饮内停,从而表现为心下悸、头眩、小便不利、四肢沉重,脉沉。现代药理学研究结果表明,真武汤具有改善大脑皮质机能的作用,其药物组成成分可以通过调节神各种信号通路、免疫炎症反应等多种生物学过程,使下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)功能平衡,改善机体肾功能,从而发挥温阳利水作用[5,6]。由于人体药物代谢吸收的复杂性与中药配伍的多样性,真武汤对CHF的具体作用机理尚不明确,网络药理学完成了由传统的单一靶点研究到系统、整体调节研究的跨越[7],为研究中药复方的作用机制提供可能性。本研究基于网络药理学的技术,对真武汤治疗CHF的作用机制进行探讨,以期为临床提供治疗参考。1、资料与方法1.1真武汤作用靶标预测真武汤由茯苓、白术、白芍、附子、生姜等5味中药组成。本研究通过中药系统药理数据库检索选中真武汤的所有化学成分,根据药物吸收、分布、代谢及排泄(ADME)特性,对检索得到的化学成分以口服生物利用度(oralbioavailability,OB≥30%)及类药性(drug-likeness,DL≥0.18)为筛选阈值标准,得到符合条件的候选化合物,并找到其对应靶点,再借助Uniprot数据库将靶蛋白转换成统一基因名,筛选条件限定物种为“homosapiens”,将重复、不规范与非人源的靶点进行剔除,仅录入符合筛选要求的靶点,最终得到真武汤活性成分的基因靶点(Genesymbol)。1.2CHF相关靶点获取借助人类基因数据库以“chronicheartfailure”为检索词,在基因数据库中检索与CHF疾病有关的靶标基因,将相关性分值筛选阈值设定为RelevanceScore≥10,以便筛选出与CHF疾病相关度更紧密的靶点。1.3中药化学成分-作用靶点网络的构建和分析利用Venny分析工具将CHF相关靶点与真武汤中药复方预测靶点相互映射,真武汤作用于CHF的靶点就是交集靶点。利用Cytoscape3.7.1软件中的“NetworkAnalyzer”插件构建真武汤化学成分-疾病的作用靶点网络并对此网络进行分析,节点(Node)代表真武汤中所含药物化学成分与潜在作用靶点;边(Edge)展现真武汤中药成分和其作用靶点之间的联系,根据化合物与靶点连接情况筛选中药作用于CHF的关键化合物。1.4PPI网络的构建及关键靶点筛选蛋白质与蛋白质之间的相互作用分析通过STRING数据库来操作。往STRING数据库导入药物-疾病交集靶点,最低相互作用评分设置为最高等置信度[“Highestconfidence(0.900)”],指定“Homosapiens”为限定研究物种,其余参数保持默认设置,得到真武汤作用于CHF的靶蛋白相互作用(PPI)网络。利用Cytoscape3.7.1软件中的“NetworkAnalyzer”对PPI网络进行拓扑分析,并分析关键靶点药理作用。1.5GO功能分析和KEGG通路富集分析利用DAVID6.8数据库对真武汤治疗CHF涉及的15个靶蛋白进行基因本体(geneontology,GO)富集分析及基因组百科全书(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)通路富集分析,输入靶基因名称列表,限定物种为“HomoSapiens”,将靶基因名修正为官方名称(“OfficialGeneSymbol”),设定阈值P<0.05,进行GO生物过程富集分析和KEGG通路富集分析。2、结果2.1药物化合物信息在TCMSP中搜索茯苓、白术、白芍、附子、生姜5味药的化合物成分,共获得504个活性化合物成分,筛选标准为同时满足OB≥30%及DL≥0.18两个条件,并筛除重复靶点共得到59个候选化合物,茯苓15个,白术7个,白芍13个,附子21个,生姜5个,其中β-谷甾醇(beta-sitosterol)为生姜与白芍共有,谷甾醇(sitosterol)为附子与白芍共有活性化学成分,详情见表1。进一步对于真武汤所得到的候选化合物进行预测,得到对应的靶点173个,通过Uniprot数据库统一基因名后相关靶点数量为79个。表1真武汤中候选化合物成分2.2疾病靶点的获取结果从GeneCards检索共得到相关靶点8203个,将relevancescore≥10设定为筛选标准,得到1699个与CHF疾病相关的靶点。2.3网络关系图的构建与分析将化合物靶点与CHF疾病靶点相互映射,筛除重复靶点后共得到15个共同靶点基因,对应真武汤15个候选化合物。利用Cytoscape3.7.1软件构建中药化合物-靶点相互作用网络,得到30个节点(中药化合物节点15个,靶基因节点15个)和67条边,见图1。图1中蓝色代表真武汤药物组成,紫三角形代表药物活性成分,白芍化合物5个,茯苓化合物4个,附子化合物4个,生姜化合物3个,白术化合物1个,其中beta-sitosterol为生姜与白芍共有,sitosterol为附子与白芍所共有;绿色椭圆形代表疾病靶点。度值较高的5个化合物Deltoin、hederagenin、beta-sitosterol、Stigmasterol、3β-acetoxyatractylone可能是真武汤发挥治疗CHF作用的关键化合物,见表2。表2真武汤关键化合物的基本信息图1真武汤中药化合物-成分-疾病靶点的网络图2.4靶蛋白相互作用网络的构建及关键靶点筛选将映射得到的15个交集靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析,结果表明有2个靶点未与其他靶点发生蛋白相互作用,网络中仅有13个发生了蛋白相互作用的靶点,蛋白之间相互作用由54条边表示,见图2。通过计算网络中每个靶点的Dgree值得到了10个与CHF有关的蛋白质靶点,分别是IL-6、CASP3、ESR1、CASP8、CASP9、ACHE、BCL2、PLAU、PON1、ADRA1A等基因,推测这些靶点可能是真武汤治疗CHF的关键靶点。图2真武汤治疗CHF的靶蛋白PPI网络图2.5GO功能分析15个药物-疾病交集基因影响24个生物学过程(P<0.01),GO功能富集的结果显示真武汤治疗疾病的基因功能主要富集在分子功能方面,相关条目有16条,涉及调控G蛋白偶联胺受体活性、肽链内切酶活性、死亡蛋白结合、乙酰胆碱受体活性、丝氨酸水解酶的活性、类固醇激素受体活性、TNF受体活性以及与神经递质的结合率来延缓CHF患者的心室重构、心室纤维化等病理变化,从而改善患者的心功能。P值排名前15的功能信息见表3,图3。图3GO富集分析柱状图(颜色代表P值,长度代表基因数)表3药物-疾病基因具有的功能信息(x±s)2.6KEGG富集通路分析结果通路富集结果表明该15个靶点显著富集在110条通路上(P<0.05),其中45条通路与CHF发生密切相关,排名前20条通路见图4。其中主要起作用的通路包括凋亡信号通路、P53信号通路、NF-кB信号通路、PI3K/Akt信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、IL-17信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号、HIF-1信号通路、钙信号通路、NOD样受体信号通路与肌动蛋白细胞骨架的调控等,提示真武汤治疗CHF可以通过以上多条通路起效,符合中医药治病多靶点、多途径的理论。图4真武汤治疗CHF关键靶点参与的通路富集信息3、讨论CHF归属于中医的“心衰病”“水肿”“喘证”的范畴,中医认为其总病机以“本虚标实”为主,心气(阳)虚是其基础病机,临床上阳虚水泛证为其常见证型,温阳利水是其关键治法。现代药理学研究表明,真武汤治疗CHF有良好疗效,对于证型属于阳虚水泛的CHF治疗效果尤其明显,然而由于中药复方配伍的多样性及人体对于药物不同的利用度,其具体的治疗作用机制尚不清楚[8,9,10]。研究GO富集分析的生物学过程、分子功能、细胞组成发现,真武汤治疗CHF主要通过对机体分子功能的影响起治疗作用,分子功能涉及受体活性、蛋白酶活性、类固醇激素受体活性调控等,生物学过程主要涉及死亡受体结合、细胞因子受体结合、神经递质结合等。这都与CHF的病情进展存在一定的联系。KEGG富集分析共富集到45条相关通路,其中细胞凋亡通路最重要。研究表明,CHF的病情进展主要由异常细胞凋亡及免疫炎症反应过度导致,心肌细胞凋亡参与了心肌梗死后心室重构、心功能不全的过程。CHF早期,细胞凋亡的触发机制异常活跃,可影响心脏收缩功能,凋亡的心肌细胞加速左室心肌重塑使得心肌收缩功能进一步下降,同时可以造成心脏血流动力学恶化,心肌细胞凋亡是心衰从代偿走向失代偿的关键因素。故在疾病发生早期尽早抑制细胞凋亡可起到治疗CHF的作用[8,9,10,11,12]。KEGG富集分析结果中有多种调控细胞凋亡及免疫炎症反应有关的信号通路,如P53信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、TNF信号通路等。P53被称为“基因组卫士”,具有如调控细胞周期、细胞自噬、细胞凋亡等功能的多效性。P53调控细胞凋亡主要体现在对CASPASE家族和BCL2家族的调控上,通过抑制BCL家族中抑制释放细胞色素c的抗凋亡基因BCL-xL和BCL-2表达和CASPASE家族的基因表达来诱导心肌细胞凋亡[13,14]。研究表明,心肌缺血后会通过一系列抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的层级反应导致心肌细胞凋亡,P53积累会导致心肌损伤从而引起血管生成障碍、纤维化,P53信号通路在心肌重塑的过程中被激活后可诱导心肌细胞凋亡最终导致CHF的发生[15]。P53诱导心肌细胞凋亡的途径在于它既可以通过与P300结合激活NF-κB信号通路造成肥大心肌细胞凋亡加重患者临床症状;又可以通过反向激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的亚单位β1和β2从而诱导细胞自噬。NF-κB作为一种具有多向性调节作用的转录因子,既可以调控促心肌细胞凋亡的基因表达,也可以调控BCL-2等抗细胞凋亡的表达。动物实验研究表明,白芍总苷可以通过下调相关蛋白的表达,显著抑制动脉粥样硬化大鼠TNF-α/P38MAPK/NF-κB/RBP4信号通路介导的粥样硬化进程,减轻细胞炎症反应从而达到延缓CHF进程的作用[16]。PI3K/Akt信号通路也是一种较为常见的生物体内信号通路。有实验研究发现,TNF-α灌注会造成左室舒张末容积增加,左室明显扩大,从而损伤心肌细胞的顺应性[17,18];同时PI3K/Akt信号通路中的蛋白因子PIK3可直接通过自身活化产生PIP3与细胞内的Akt结合使促使Akt蛋白磷酸化,达到诱导细胞凋亡的目的[19,20]。研究表明,附子的活性成分中有机酸类化合物具有诱导细胞凋亡、抗血栓及抗炎等作用,诱导细胞凋亡主要通过调控PI3K/Akt信号通路,MAPK信号通路达成[21]。综上所述,真武汤对于CHF的治疗作用主要是通过调控与细胞凋亡及炎症反应有关的信号通路实现的,同时也通过调节钙信号通路等多种代谢途径起效,所得结果与现有研究结果高度吻合。本研究的局限性在于仅能做到系统地预测药物化学成分作用的靶点,未将人体对药物的吸收度及药物之间的配伍关系纳入研究范围,且无法预测功能改变的方向及靶点的上下游关系。因此,更加严谨的结果需经过日后的动物研究及体内外试验得出,为治疗本病提供更可靠的科学依据。参考文献：[1]钟晓莹,陈国铭,赵金龙,等.苓桂术甘汤治疗慢性心衰的靶点预测与机制探讨[J].时珍国医国药,2018,29(11):2792-2797.[3]中华医学会心血管病学分会心力衰竭学组,中国医师协会心力衰竭专业委员会,中华心血管病杂志编辑委员会.中国心力衰竭诊断和治疗指南2018[J].中华心血管病杂志,2018,46(10):760-789.[5]张滨滨,屠鸿萍,叶呈广,等.真武汤急症应用探析[J].中国中医急症,2019,28(1):164-166.[6]王皓霖,胡黎文,张金龙,等.真武汤合桂枝茯苓丸治疗肾阳虚型慢性心力衰竭42例[J].西部中医药,2019,32(2):95-98.[7]李泮霖,苏薇薇.网络药理学在中药研究中的最新应用进展[J].中草药,2016,47(16):2938-2942.[8]纪焕文,赵肸,张金盈.肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8样分子2对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制[J].中华实用诊断与治疗杂志,2019,33(3):224-227.[9]王治,黄进,王新宁,等.慢性心力衰竭患者血浆Elabela水平变化及意义[J].中华实用诊断与治疗杂志,2017,31(9):899-901.[10]郭丽,邓萌,王露露,等.心力衰竭大鼠氧化应激水平与炎症因子､细胞凋亡因子间的相关性[J].心血管康复医学杂志,2018,27(5):495-498.[13]任汐鹰,刘勤献,王海英.p53与细胞死亡[J].中国生物化学与分子生物学报,2018,34(6):588-594.[14]周思维,王宇,左权,等.血清剥夺抑制心肌细胞增殖､促进凋亡及对P53和Wnt/β-catenin信号通路的影响[J].第二军医大学学报,2019,40(2):157-161.[15]常宏,田立茹,李佳凝,等.p53信号通路在心力衰竭中的作用机制[J].华北理工大学学报(医学版),2019,21(1):76-80,84.[16]苏绍红,张琳,张俊峰.白芍总苷对动脉粥样硬化大鼠TNF-α/P38MAPK/NF-κB/RBP4信号通路及其血清IL-17,IL-27,IL-33影响的研究[J].新中医,2019,51(7):18-21.[18]高晓丽,刘英华,张小坤,等.慢性心力衰竭患者外周血肿瘤坏死因子-αmRNA转录和蛋白表达与信号通路PI3K/AKT活化的临床研究[J].实用医学杂志,2019,35(3):412-415.[21]杨欣,李亚辉,潘恩佳,等.基于PI3K/Akt信号通路筛选附子-半夏抗肿瘤的活性成分及关键靶点[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(10):170-179.张莉,仇媛,白强,高积慧.基于网络药理学预测真武汤防治慢性心力衰竭的作用机制[J].中医学报,2020,35(08):1763-1769.
