草质素的应用对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脂肪变和肝内氧化应激影响分析.docx

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草质素的应用对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脂肪变和肝内氧化应激影响分析草质素是从红景天、笔筒草、棉花等植物中分离出的一种黄酮类物质[1,2,3,4]。草质素可以通过调节人肝癌细胞HepG2细胞活性氧介导的线粒体凋亡通路，促进癌细胞凋亡，达到抗癌的作用。草质素还具有较强的抗氧化能力，可以清除氧自由基和抑制蛋白质的氧化[5,6]。本研究采取高脂饮食诱导SD大鼠建立NASH模型，研究了草质素对动物肝内脂肪变性和氧化应激反应的影响。1、材料与方法1.1动物、药品、试剂与仪器40只SPF级雄性SD大鼠购自湖北省武汉市疾病预防控制中心，6～8周龄【合格证号:SCXK(鄂)2011-0005】。草质素(成都瑞芬思生物公司，纯度≥98%);基础饲料、高脂饲料(武汉饲料公司);检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、血红素氧化酶(HO-1)试剂盒(南京建成生物公司);抗β-actin、抗Nrf2、抗细胞色素P450酶2E1(CYP2E1)和抗细胞色素P450酶4A(CYP4A,Santa生物公司);RIPA裂解液、SDS上样缓冲液、ECL发光液(碧云天生物公司);BCA试剂盒(Thermo公司);Cocktail(Roche生物公司)。台式低温高速离心机(Eppendorf公司);iMARKTM酶标仪(BIO-RAD公司);电子天平(Sartorius公司);电热恒温水浴箱(精宏实验设备有限公司);旋涡混合器(其林贝尔公司);电泳仪、垂直电泳槽、电转仪(六一仪器厂);Imager2000凝胶成像分析仪(AlphaInnotech公司)。1.2动物模型的制备先用基础饲料喂养动物于SPF级动物房1w。将大鼠分为对照组，用基础饲料喂食12w,NASH模型组，用高脂饲料喂食12w，小剂量草质素处理组，在喂食高脂饲料的同时，给予草质素20mg·kg-1，灌胃处理12w和大剂量草质素处理组，在喂食高脂饲料的同时，给予草质素40mg·kg-1，灌胃处理12w。实验结束时，禁食12h，经眼眶取血，断颈处死动物，取肝脏。1.3肝匀浆生化指标检测取0.2g肝组织，加生理盐水1.8ml，在冰水浴中匀浆，检测TG、TC、FFA、MDA、SOD、CAT、GSH-Px和HO-1酶活性。1.4肝组织蛋白表达检测采用Westernblotting法，取肝组织50mg，加入裂解液0.5ml，匀浆，冰上裂解30min，将得到的液体以12000g在4℃离心15min，上清即为总蛋白。检测蛋白浓度，每管分装50μg，水浴变性，温度为100℃，处理10min。用SDS-PAGE胶电泳，分离总蛋白，保留目标蛋白并电转至PVDF膜，与特异性的一抗和二抗在37℃各孵育1h，经ECL发光液显色，分析结果。1.5统计学方法应用SPSS17.0软件处理和分析，计量资料以(±s)表示，采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。2、结果2.1各组大鼠肝指数的变化与对照组比，模型组体质量、肝质量和肝指数均显著升高(P<0.05);与模型组比，小剂量和大剂量药物处理组肝质量和肝指数均显著降低(P<0.05)，大剂量组体质量也显著降低(P<0.05，表1)。表1各组大鼠体质量、肝质量和肝指数(n=10,±s)比较与对照组比，(1)P<0.05;与模型组比，(2)P<0.05 2.2各组大鼠血生化指标比较与对照组比，模型组大鼠血清ALT、AST、LDL-C、TG、TC、FFA均显著升高(P<0.05);与模型组比，小剂量和大剂量草质素处理组大鼠血清ALT、AST、LDL-C、TG、TC和FFA水平均显著降低(P<0.05，表2)。2.3各组大鼠肝匀浆脂质含量比较与对照组比，模型组大鼠肝匀浆TG、TC和FFA水平显著升高(P<0.01);与模型组比，小剂量和大剂量组肝匀浆TG、TC和FFA水平显著降低(P<0.05，表3)。2.4各组大鼠肝匀浆氧化应激相关指标比较与对照组比，模型组大鼠肝匀浆MDA水平升高(P<0.01)，而SOD、CAT、GSH-Px和HO-1水平显著降低(P<0.01);与模型组比，小剂量和大剂量组肝匀浆MDA水平显著降低(P<0.01)，而SOD、CAT、GSH-Px和HO-1水平显著升高(P<0.05，表4)。表2各组大鼠血生化指标(n=10,±s)比较与对照组比，(1)P<0.05;与模型组比，(2)P<0.05表3各组大鼠肝匀浆脂质含量(±s)比较与对照组比，(1)P<0.05;与模型组比，(2)P<0.05表4各组大鼠肝匀浆氧化应激相关指标(±s)比较与对照组比，(1)P<0.05;与模型组比，(2)P<0.05 2.5各组肝组织蛋白表达情况比较与对照组比，模型组大鼠肝组织Nrf2蛋白相对表达量降低(P<0.01)，而CYP2E1和CYP4A蛋白相对表达量显著升高(P<0.01);与模型组比，小剂量和大剂量草质素处理组肝组织Nrf2蛋白相对表达量升高(P<0.01)，而CYP2E1和CYP4A蛋白相对表达量降低(P<0.05，图1)。3、讨论草质素是红景天属的植物中主要的黄酮类化合物，红景天是《神农本草经》中的上品，越来越多的研究证明红景天中黄酮类物质的药理活性比其中的苷类和多糖类更优，而红景天黄酮类化合物最主要的药理作用包括抗氧化、调节血脂和护肝作用[7,8,9,10]。因此，红景天黄酮类物质在治疗NASH方面有良好的前景。图1各组大鼠肝组织蛋白表达量比较与对照组比，#P<0.05,##P<0.01;与模型组比;*P<0.05,**P<0.01本研究结果显示，模型组血清FFA水平升高，可以反映出肝脏脂质堆积。应用草质素处理可以降低肝内脂肪堆积，说明草质素可以改善高脂饮食引起的肝脏脂肪变，缓解第一次打击带来的损伤[11,12]。肝脏MDA含量检测结果显示，高脂饮食会导致大鼠肝匀浆MDA含量增加，草质素可以降低模型组大鼠肝匀浆MDA含量，说明草质素可以缓解高脂饮食引起的氧化损伤。SOD、CAT、GSH-Px和HO-1是机体抗氧化防御系统最主要的组成成分，可以清除大部分的自由基，维持氧化系统的平衡[13,14,15,16,17]。高脂饮食会抑制SD大鼠肝脏SOD、CAT、GSH-Px和HO-1酶活性，同时给予草质素灌胃可以提高这些酶的活性，提高机体抗氧化能力。Nrf2是细胞内抗氧化还原反应最核心的调节因子，它不仅可以提高机体清除自由基的能力，还可以抑制自由基的生成。CYP2E1和CYP4A是主要生成自由基的酶系，与NASH患者体内氧化应激失衡有密切的关系[18]。本研究结果显示高脂饮食会抑制Nrf2蛋白表达，而促进CYP2E1和CYP4A蛋白表达。给予草质素可以促进Nrf2的表达，抑制CYP2E1和CYP4A表达。根据这些结果，我们推测草质素可能主要是通过激活大鼠肝脏Nrf2表达，提高抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px和HO-1活性，促进机体自由基的清除速度。抑制自由基生成酶CYP2E1和CYP4A的表达，抑制自由基产生，降低肝脏自由基含量，减缓脂质过氧化反应，降低了MDA含量，改善了氧化应激紊乱，缓解了第二次打击的伤害[19,20]。王雨,王楠,刘媛媛,李永勤,王巧侠,付建军.草质素对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脂肪变和肝内氧化应激的影响[J].实用肝脏病杂志,2020,23(05):626-629.基金:西安市科技计划项目【编号:2019115413YX009SF042(4)】.