云南边境地区的蓝舌病流行和分布情况探究蓝舌病（BT）是由蓝舌病病毒（BTV）引起的，通过媒介昆虫库蠓传播的虫媒病毒病[1]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其归为一类动物疫病。该病主要发生在热带、亚热带地区，近年来有北移趋势，主要引起绵羊、牛等反刍动物发病，尚无有效的治疗方法[2]。目前全球已报道27种BTV血清型，我国分离到BTV-1、2、3、4、5、7、9、12、14、15、16、21、24等13种血清型[3,4,5,6,7,8,9,10]。不同血清型毒株在同一区域同时流行时，容易发生基因重组，且不同血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，这给BT防控带来了严峻挑战[11,12]。云南省地处我国西南边陲，有5个州市25个县（市）与缅甸、老挝和越南交界，有11个国家级口岸、9个省级口岸及数百条边境通道，边境线长4060km，是我国通往东南亚、南亚的关口。近年来，由于国内肉类价格持续增高，每年有大量牛等活动物通过边境线进入我国境内，使云南省边境地区BT防控形势更为严峻。为掌握云南省边境地区BT流行情况，本研究采用BTVC-ELISA抗体检测试剂盒和微量血清中和试验方法，对2019年云南省边境5个州市12个县（市）送检的1580份牛血清样品进行了BTV检测和血清分型，以期为我国BT防控提供参考。1、材料与方法1.1血清样品牛血清样品来自云南省边境地区5个州市12个边境县（市），其中德宏州（芒市、瑞丽市）365份，西双版纳州（景洪市、勐海县、勐腊县）649份，文山州（富宁县）31份，普洱市（孟连县、西盟县、江城县）255份，临沧市（沧源县、镇康县、耿马县）280份，均由所在县（市）的动物疫病预防控制中心送检。1.2主要仪器和试剂MultiskanFC酶标仪，购自Thermo公司；脱脂奶粉，购自BDdifco公司；BTVC-ELISA检测试剂盒、PBSTM（磷酸盐缓冲液+Tween20+脱脂奶粉），为云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备；BTV24个型的参考病毒，由本实验室保存；CorningIncorporated96孔细胞培养板、PBS干粉、Tween20，均购自云南丰科生物科技有限公司。1.3血清抗体检测按照BTVC-ELISA试剂盒说明书，对待检血清进行检测，读取OD450值，计算血清样品抑制率，判定血清是否为阳性[13]。试剂盒质控标准：两个阳性对照孔OD450≤0.2，两孔间OD450差值<0.05，两个阴性对照孔1.0≤OD450<1.6，两孔间OD450差值<0.2。判定标准：按照抑制率（PI）=（阴性对照OD450平均值-样品血清OD450值）/阴性对照OD450平均值×100%；抑制率≥50%，判为抗体阳性，否则为阴性。1.4统计学分析采用SPSS22.0软件进行统计学分析，以P<0.05为差异存在统计学意义。1.5血清型鉴定从C-ELISA检出的BTV阳性血清样品中，每县（市）随机挑选15～55份进行微量血清中和试验；按Karber方法计算24个血清型标准毒株的半数感染量（TCID50）；参照GB/T18636—2017[14]中的方法，将24个BTV标准毒株与BTV抗体阳性血清进行中和试验，确定BTV血清型。2、结果与分析2.1抗体检测2.1.1地区分布从各县（市）送检的1580份牛血清样品中，均检测到BTV抗体阳性血清（表1），共检出阳性血清1155份，抗体阳性率为73.1%，表明牛BTV感染在云南省边境地区普遍存在。各县（市）BTV抗体阳性率有所差异，其中芒市最高（94.1%），沧源县最低（17.0%）。各州市BTV总阳性率比较结果显示：临沧市最低（43.6%），与其他州市差异均显著（P<0.05）；西双版纳州与德宏州比较，差异存在统计学意义（P<0.05）。2.1.2群间分布本地牛和入境牛BTV血清抗体统计结果（表2）显示：本地牛和入境牛血清BTV抗体阳性率差异不大（P>0.05），分别为74.1%和72.9%。表1云南边境地区牛BTV血清抗体检测结果统计表2本地牛和入境牛BTV血清抗体统计2.2血清型鉴定2.2.1BTV血清型分布对随机选取的541份BTV抗体阳性血清样品进行血清微量中和试验检测。结果（表3）显示：共鉴定出17种血清型，数量在100份以上的依次是BTV-1、16、3、5、21、15。各县（市）均存在5个以上血清型分布，其中：景洪市最多，有14个，沧源县最少，有5个，其他县（市）在6～11个之间。各州（市）优势血清型并不相同，德宏州2个市均存在BTV-3、5、15、16、17、18、21、24型8个血清型；西双版纳州1市2县均存在BTV-1、13、16、21、24型5个血清型感染，普洱市3县均存在BTV-4型，临沧市3县均存在BTV-3、5、21型3个血清型。表3各县（市）牛BTV阳性血清中和抗体检测结果2.2.2BTV血清型混合统计对各县（市）存在的16个BTV血清型进行混合感染统计的结果（表4）显示：在541份血清型定型样品中，存在77种两种血清型混合感染，其中BTV-3型与BTV-5型混合感染样品数量最多，有18份，占定型样品总数的3.3%；其次是BTV-16型与BTV-21型混合感染，有15份，占定型样品总数的2.8%,BTV-3型与BTV-16型、BTV-5型与BTV-16型混合感染均有14份，占定型样品总数的2.6%。3、讨论虫媒病毒病防制极为困难，全球每年因BTV感染而导致的经济损失高达30亿美元[15]。我国对BT等动物虫媒病的研究相对滞后。1979年张念祖等[15]首次在云南省师宗县发现BTV，此后湖北（1983）、安徽（1985）、四川（1988）等省份分别报道发现BTV。2017年血清学和病原学流行病学调查发现，我国11个省份63个市区检测到BTV抗体阳性[16,17,18,19,20]。BTV可能会因库蠓移动传播、新血清型传入和致病性增强等引起牛群大规模发病，影响牛产业健康发展及相关畜产品贸易[21]，因此加强BTV血清学调查对该病的预防与控制极为重要。本次检测在云南省边境地区5个州市12个县（市）的送检牛血清样品中均检测到BTV抗体，表明BTV在云南边境地区流行广泛。本研究的云南省12个边境县（市）均位于热带或者亚热带地区，与越南、老挝、缅甸接壤，年均气温较高、日照时间较长、降雨量较多，适于各类库蠓生长和繁殖，有利于BTV传播。由于本次检测样品数量有限，且均为送检样品，检出结果可能不能真实反映该地流行情况，但对于了解BTV在该地的流行状况和特点具有参考意义。来源地为本地和境外的牛血清样品间抗体阳性率差异不显著（P>0.05），说明云南边境地区BTV流行态势与缅甸、老挝、越南类似，这可能与云南边境地区气候环境、传播媒介等与上述三个国家类似有关。表4各县（市）牛BTV血清型交叉感染情况统计本研究应用微量血清中和试验，进行BTV血清型鉴定，发现各市县均存在5个以上的血清型分布，这可能与不同血清型BTV毒株在同一区域或宿主机体感染时易发生基因重组的特性有关。此外，在各州（市）流行的优势血清型也不同，这可能与地理位置和传播媒介库蠓的种类差异有关[22]。4、结论检测发现，BT在我国云南边境地区流行广泛，且流行血清型复杂，多种血清型混合感染较严重，需要持续开展血清学调查。参考文献：[3]肖雷,孟锦昕,李华春,等.蓝舌病病毒BTV-1型的分离鉴定[J].上海畜牧兽医通讯,2014(4):5-7.[4]林俊,白安斌,吴健敏,等.广西家养反刍动物蓝舌病血清学监测分析[J].南方农业学报,2012,43(10):1580-1583.[5]李占鸿,肖雷,李华春,等.中国蓝舌病病毒血清5型毒株的分离鉴定[J].中国兽医科学,2019,49(1):36-43.[6]吕敏娜,孙铭飞,李华春,等.蓝舌病病毒7型毒株的分离与分子鉴定[J].畜牧兽医学报,2017,48(7):1281-1287.[7]李占鸿,王金萍,李华春,等.蓝舌病病毒血清9型毒株在我国的首次分离[J].畜牧兽医学报,2019,50(2):354-363.[8]毛立,李文良,李华春,等.江苏省部分地区牛羊蓝舌病血清学调查及监控[J].西南农业学报,2015,28(6):2784-2787.[9]张玲,宋迎春,钟旗,等.新疆蓝舌病病毒的分离及初步鉴定[J].中国兽医学报,2016,35(6):312-316.[10]曹雨,张莹辉,印春生,等.蓝舌病毒14型的分离与鉴定[J].中国兽医科学,2019,49(7):855-860.[11]段正赢,戴德强,田永祥,等.2013年湖北省山羊蓝舌病血清学调查[J].畜牧与兽医,2016(2):110-112.[12]杨恒,王金萍,李华春,等.我国蓝舌病病毒24型毒株的分离和遗传特征分析[J].中国兽医学报,2019,39(1):31-37.[13]苗海生,李乐,李华春,等.蓝舌病多克隆抗体CELISA检测方法的建立和比较研究[J].云南农业大学学报,2014,29(1):58-62.[14]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.蓝舌病诊断技术:T18636—2017[S].北京:国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会,2017.[15]张念祖,张开礼,李志华,等.绵羊蓝舌病的调查研究报告[J].云南畜牧兽医,1989(4):3-12.[16]谭邵敏,白安斌,吴健敏,等.广西山羊蓝舌病血清学调查及流行区域分布的影响因素分析[J].中国预防兽医学报,2011,33(1):28-31.[17]王慧,覃岚,尹鑫,等.2012年贵州羊蓝舌病血清流行病学调查及影响因素分析[J].中国动物检疫,2013,30(11):52-56.[18]吕敏娜,林丽琴,陈琴苓,等.广东地区蓝舌病流行病学初步研究[J].中国预防兽医学报,2015,37(7):499-501.[19]毛立,李文良,杨蕾蕾,等.江苏省部分地区牛羊蓝舌病血清学调查及监控[J].西南农业学报,2015,28(6):2784-2787.[20]张胜男,李华春,朱建波,等.2015年内蒙古地区蓝舌病及流行性出血热流行病学调查及血清型鉴定[J].中国预防兽医学报,2016,38(12):939-943.寇美玲,谢佳芮,李乐,苗海生.云南省边境地区送检牛血清样品蓝舌病病毒抗体检测与血清型鉴定[J].中国动物检疫,2020,37(10):16-20.基金:云南省技术创新人才培养对象项目(2018HB076);国家重点研发计划项目(2017YFC1200502)。
