田鼠型和古典型鼠疫菌抗性中不同宿主动物血清的使用对比研究鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)引起的烈性传染病。鼠疫耶尔森菌根据其糖醇酵解能力不同曾被分为三个生物型:古典型、中世纪型、东方型,而这三型鼠疫菌与人类历史上三次鼠疫大流行有关。而周东生等研究发现提出了新的生物型—对人类不致病的田鼠型[1]。本研究无菌条件下分别采集健康成人血清、正常豚鼠血清、正常Balb/c小鼠血清,每种血清分成三组:正常组、灭活组及PBS盐水对照组。定量感染田鼠型和古典型鼠疫菌,观察三种血清对不同培养温度、不同作用时间鼠疫菌的生长情况,比较三种不同宿主动物血清抗性的差异,及同种血清正常组与灭活组对鼠疫菌抗性敏感性。1、材料与方法1.1研究用菌株鼠疫菌91001株、鼠疫菌141株均由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室提供。1.2血清健康成人血清;正常豚鼠血清;正常Balb/c小鼠血清及PBS对照组。1.3培养基溶血赫氏平皿、LB液体培养基,均由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室提供。1.4方法1.4.1血清采集实验前无菌条件下对健康成人、正常豚鼠、正常Balb/c小鼠采血、离心,无菌收集血清,4℃。定量分装每种血清(200μl/支)至1.5ml无菌EP管中。-86℃保存,使用前血清冰上融化。1.4.2灭活宿主动物血清分别取上述定量分装宿主动物血清,每种动物血清各取12支,56℃30min灭活,4℃备用。1.4.3PBS对照组配制PBS盐水,高压灭菌后定量分装至1.5mlEP管中(200μl/支)。1.4.4菌悬液制备1.4.4.1菌株复苏鼠疫菌91001株和141株从甘油低温保存状态分别复苏于5ml肉汤中,28℃200rpm24h;复苏成功后接种于5mlLB液体培养基中,分别置28℃、37℃,200rpm17h。用分光光度计测OD值,调整OD620至1.0左右(鼠疫菌为1×108CFU/ml)。1.4.4.2细菌与血清相互作用将上述不同培养温度的菌悬液(OD620=1.0)各取50μl,分别加入不同组宿主动物血清中(加入前30min将各组血清从-86℃冰柜中取出置于室温融化备用),即正常组、灭活组及PBS对照组,200μl/管,并将不同鼠疫菌和血清混合液置37℃200rpm分别作用30min、1.5h、2.5h后,冰浴5min终止反应。1.4.4.3菌液血清混合液稀释,涂板计数将终止反应的混合液依次10倍稀释,取0.1ml滴于溶血赫氏平皿,L棒涂抹均匀,每个稀释度3个重复,28℃48h后观察结果并计数。2、结果2.1健康成人血清不同鼠疫菌不同培养温度杀菌效力结果取每组三个重复计数结果的均数作为结果,不同生物型不同培养温度鼠疫菌(28℃、37℃)血清杀菌效力结果见表1。2.2正常豚鼠血清不同鼠疫菌不同培养温度杀菌效力结果取每组三个重复计数结果的均数作为结果,不同生物型不同培养温度鼠疫菌(28℃、37℃)血清杀菌效力结果见表2。2.3正常Balb/c小鼠血清不同鼠疫菌不同培养温度杀菌效力结果取每组三个重复计数结果的均数作为结果,不同生物型不同培养温度鼠疫菌(28℃、37℃)血清杀菌效力结果见表3。2.4不同宿主动物血清不同反应时间不同鼠疫菌间比较结果(见表4)2.5健康成人血清与不同生物型鼠疫菌作用不同时间血清抗性比较(见图1)根据实验结果制成柱状图,由图中显示作用30min,不同培养条件下正常人血清和灭活人血清对古典型鼠疫菌141株均有明显抗性;正常人血清与28℃培养的141株和田鼠型鼠疫菌91001株作用的抗性均强于37℃培养同类菌株;作用1.5h后,正常人血清对37℃培养的古典型鼠疫菌141株抗性明显增强,而灭活人血清对鼠疫菌141株37℃的抗性有所下降;作用1.5h后,正常人血清对28℃和37℃培养的田鼠型鼠疫菌91001株抗性明显增强;作用2.5h后,正常人血清对37℃培养的古典型鼠疫菌141株和田鼠型鼠疫菌91001株抗性均显著提高。图1健康成人血清对不同生物型鼠疫菌抗性效力柱状图2.6古典型鼠疫菌141株(28℃和37℃)和田鼠型鼠疫菌91001株(28℃和37℃)与豚鼠血清作用不同时间血清抗性比较(见图2)图2显示,作用30min时,与PBS对照组相比豚鼠正常血清对古典型鼠疫菌141株(28℃)和田鼠型鼠疫菌91001株(28℃和37℃)均有抗性,但灭活豚鼠血清对古典型鼠疫菌141株(28℃和37℃)和田鼠型鼠疫菌91001株(28℃和37℃)均无抗性,而且灭活血清还不同程度地表现刺激鼠疫菌生长的作用;作用1.5h后,无论是正常豚鼠血清还是灭活豚鼠血清,对古典型鼠疫菌141株(28℃和37℃)和田鼠型鼠疫菌91001株(28℃和37℃)均无抗性;作用2.5h后,豚鼠血清对鼠疫菌(141株和91001株)基本无抗性,还不同程度地刺激鼠疫菌生长。图2豚鼠血清对不同生物型鼠疫菌抗性效力柱状图2.7古典型鼠疫菌141株(28℃和37℃)和田鼠型鼠疫菌91001株(28℃和37℃)与小鼠血清作用不同时间比较Balb/c小鼠血清抗性柱状图见图3。图3Balb/c小鼠血清对不同生物型鼠疫菌抗性效力柱状图图3显示,作用30min,Balb/c小鼠正常血清对28℃培养的古典型鼠疫菌和田鼠型鼠疫菌均有较弱的抗性,对37℃培养的古典型鼠疫菌和田鼠型鼠疫菌均无抗性;Balb/c小鼠灭活血清对两种生物型的鼠疫菌均无抗性;作用1.5h,Balb/c小鼠正常血清对两种生物型鼠疫菌(28℃和37℃)抗性均明显增强,而Balb/c小鼠灭活血清对古典型鼠疫菌(37℃)和田鼠型鼠疫菌(28℃和37℃)抗性有所增强,但对古典型鼠疫菌(28℃)仍无抗性;作用2.5h,与PBS对照组相比,Balb/c小鼠正常血清和灭活血清对两种生物型鼠疫菌(28℃和37℃)均无血清抗性,相反,血清还不同程度地表现出刺激鼠疫菌生长的作用。2.8作用30min不同宿主动物血清对不同生物型鼠疫菌抗性效力的比较(见图4)图4作用30min不同宿主动物血清对不同生物型鼠疫菌抗性效力柱状图图4显示,在三种不同宿主动物血清间,作用30min时对古典型鼠疫菌141株(28℃)、人血清(正常与灭活)抗性最强,豚鼠正常血清次之,Balb/c小鼠血清较差,但豚鼠灭活血清例外,对古典型鼠疫菌141株(28℃)无抗性,还表现出反作用刺激鼠疫菌生长;对古典型鼠疫菌141株(37℃)而言,人血清(正常与灭活)抗性最强,Balb/c小鼠血清次之,豚鼠血清(正常与灭活)最差无抗性还反向刺激鼠疫菌生长;对田鼠型鼠疫菌(28℃和37℃),人血清有较强抗性,而豚鼠血清和Balb/c小鼠血清均无抗性,还表现反向刺激生长作用。2.9作用1.5h时不同宿主动物血清对不同生物型鼠疫菌抗性效力的比较(见图5)图5作用1.5h不同宿主动物血清对不同生物型鼠疫菌抗性效力柱状图图5显示,在三种不同宿主动物血清间,作用1.5h时对古典型鼠疫菌141株(28℃),人正常血清与Balb/c小鼠正常血清抗性较强,豚鼠血清(正常和灭活)和Balb/c小鼠灭活血清对古典型鼠疫菌141株(28℃)无抗性,还表现出反向刺激鼠疫菌生长;对古典型鼠疫菌141株(37℃)而言,人正常血清抗性最强,Balb/c小鼠血清次之,豚鼠血清(正常与灭活)抗性最差还反向刺激鼠疫菌生长;对田鼠型鼠疫菌(28℃和37℃),人血清(正常和灭活)有很强抗性;Balb/c小鼠血清对田鼠型鼠疫菌(28℃)有抗性,而对田鼠型鼠疫菌(37℃)基本无抗性;豚鼠血清田鼠型鼠疫菌(28℃和37℃)均无抗性,还表现反向刺激生长作用。2.10作用2.5h时不同宿主动物血清对不同生物型鼠疫菌抗性效力的比较(见图6)图6作用2.5h不同宿主动物血清对不同生物型鼠疫菌抗性效力柱状图图6显示,在三种不同宿主动物血清间,作用2.5h时,只有正常人血清对古典型鼠疫菌和田鼠型鼠疫菌不同培养温度菌株仍有抗性,而灭活人血清和豚鼠血清(正常/灭活)及Balb/c小鼠血清(正常/灭活)对不同培养温度的古典型鼠疫菌141和田鼠型鼠疫菌91001均无抗性,且呈现出反向刺激生长作用。3、讨论鼠疫是由鼠疫菌引起的烈性传染病,同时鼠疫菌又是最有可能使用的生物战剂之一。2000年世界卫生组织将鼠疫列为重新抬头的传染病[2]。我国鼠疫流行态势与全世界鼠疫流行态势基本一致,目前全国共有13种类型的鼠疫自然疫源地,分布在19个省(区),占国土面积的15%左右。多年的鼠疫监测结果表明,我国动物间疫情连年发生,疫源地面积不断扩大,人间鼠疫病例从1990年的16例上升到2014年的855例[3,4,5]。周冬生等[1,6,7]研究显示,田鼠型鼠疫菌与其他生物型鼠疫菌毒力差别很大,其对小家鼠、沙土鼠具有很强的特异性毒力,而对大动物表现为弱毒或无致病力[8]。根据对甘油、硝酸盐、阿拉伯糖的代谢能力提出新的鼠疫菌生物型—田鼠型,自此,鼠疫耶尔森菌被分成四个生物型:古典型、中世纪型、东方型和田鼠型。本实验选用鼠疫菌为古典型鼠疫菌141株是鼠疫菌强毒力株的代表性菌株,而田鼠型鼠疫菌91001株是进行了全基因组测序的弱毒株[7]。通过本实验发现:①不同培养温度(28℃和37℃)的同一生物型鼠疫菌与同一种宿主动物血清作用后比较,血清抗性与菌株培养温度的差异无统计学意义,即同一种血清与不同培养温度的同一生物型鼠疫菌作用,血清抗性无差异;②同一种宿主动物血清灭活与否,血清抗性有明显差异:同一生物型菌株,正常血清抗性强于其灭活血清,差异有统计学意义;③不同生物型鼠疫菌比较(田鼠型与古典型),相同条件下同一宿主动物血清对田鼠型鼠疫菌的抗性强于古典型鼠疫菌,差异有统计学意义。④鼠疫菌与宿主动物血清作用从30min开始逐步产生抗性,至1.5h血清抗性增强至最大功效,随着感染时间的延长,至2.5h除人体正常血清外,人体灭活血清、Balb/c小鼠血清(正常/灭活)及豚鼠血清(正常/灭活)抗性将减弱甚至呈现反向刺激鼠疫菌生长作用。此前有国外学者研究发现不同型鼠疫菌在不同培养温度下血清抗性不同,研究显示在不同温度下培养的不同型鼠疫菌,其脂多糖的组成结构不同。多粘菌素B(PMB)和血清抗性因培养温度改变而存在显著性差异[9]。而国内对血清抗性的研究多见于家禽鸡源性疾病[10,11,12],在鼠疫方面血清抗性的相关研究国内尚未报道。田鼠型鼠疫菌对大动物及人不致病,而非田鼠型鼠疫菌—古典型菌株141强毒标准株对小动物、大动物及人均表现为强致病性。鼠疫菌致病性与鼠疫菌的毒力和机体的易感性有关[13]。根据前期实验研究结果推断田鼠型鼠疫菌在侵入人或大动物宿主体内初期,可被血液中某些因子迅速识别并杀灭[14]。本研究从不同宿主血清与菌株作用后菌落数量改变上检测比较不同宿主动物血清对不同生物型鼠疫菌的抗性差异。国外的研究显示,不同培养温度的鼠疫菌其脂多糖(LPS)组成和结构不同,不同温度下各种鼠疫菌对血清抵抗力不同,其抗性变化与温度变化相对应[10]。后续研究中将提取不同培养条件下不同生物型鼠疫菌脂多糖(LPS),从LPS分子结构进一步研究鼠疫菌不同生物型的致病机制。参考文献：[1]周冬生,童宗中,宋亚军,等.鼠疫耶尔森菌生物型变异遗传基础的研究和新生物型-田鼠型的提出[J].解放军医学杂志,2004,29(3):211-215.[3]纪树立,张海峻,刘云鹏,等.我国鼠疫菌分型及其生态学､流行病学意义[J].中国地方病学杂志,1987,6(5):257-263.[4]朱锦沁,李敏,王丽,等.青海省鼠疫疫源地鼠疫菌某些生物学特性及其流行病学意义的研究[J].疾病预防控制通报,1994,9(l):l.[5]纪树立.鼠疫[M].北京:人民卫生出版社,1988.[6]周冬生,韩延平,宋亚军,等.鼠疫耶尔森氏菌基因组进化与生态位适应研究[J].解放军医学杂志,2004,29(3):204-210.[7]宋亚军,童宗中,王津,等.鼠疫耶尔森菌菌株91001全基因组序列测定及初步分析[J].解放军医学杂志,2004,29(3):192.[8]张志凯,俞东征,张建华,等.布氏田鼠鼠疫菌102k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