浅析小鼠心肌细胞凋亡受亚慢性砷暴露作用情况.docx

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浅析小鼠心肌细胞凋亡受亚慢性砷暴露作用情况砷（As）是一种天然存在的类金属，几乎存在于所有环境介质中，如空气、土壤和水。其中，通过砷污染的地下水造成的慢性砷中毒严重威胁人类和动物健康[1,2]。砷一旦被吸收就会分布到肝、肺、肠壁、脾脏和心脏等器官，对机体造成危害[3]。给予小鼠腹腔注射三氧化二砷（5mg/（kg·d))10d，可引起心电图ST段抬高和QT间期延长，心肌氧化应激增加，抗氧化防御能力下降，心肌膜损伤和炎性因子释放[4]。胚胎期亚慢性砷暴露会导致胎鼠心脏畸形，包括室间隔缺损、房间隔缺损和法洛三联征[5]。大鼠胚胎期至青春期砷染毒可导致大鼠收缩压和舒张压升高，心肌细胞发生肿胀、变性等组织病理学改变，电镜超微结构观察到心肌细胞线粒体、闰盘、细胞核均发生不同程度改变[6]。然而对于砷引起心脏毒性机制的认识还不深入。本试验选用C57BL/6小鼠作为试验对象，通过饮水砷暴露建立亚慢性砷中毒小鼠模型，利用全自动生化分析仪检测血清心肌酶谱水平，评估心肌损伤情况，并采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，采用实时荧光定量PCR技术检测凋亡通路相关基因的表达，为进一步探讨砷致小鼠心肌损伤的机制奠定基础。1、材料和方法1.1试验动物选取40只5周龄、体质量为20～22g的SPF级雄性C57BL/6小鼠用于试验。小鼠购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。1.2试验方法1.2.1试验设计预饲7d后，40只小鼠随机分为对照组及低、中、高剂量砷暴露组，自由饮食和采水。对照组小鼠饮去离子水，低、中、高剂量组分别饮含0.15、1.50、15.00mg/L三氧化二砷（As2O3）的去离子水。试验周期为90d。所有试验均符合山西农业大学实验动物伦理委员会的章程。试验结束后，小鼠称质量、麻醉，腹主动脉采血，收集血清于-20℃保存；同时分离心脏组织并称质量，按照公式计算不同浓度砷暴露组间脏器系数后，液氮保存用于基因表达检测；部分心脏置于4%多聚甲醛中固定，用于石蜡切片制作。脏器系数=心脏质量/体质量×100%(1)1.2.2血清心肌酶活性测定采用全自动生化分析仪检测血清心肌酶活力，其中，肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟基丁酸脱氢酶（HBDH）采用速率法测定；谷草转氨酶（AST）采用苹果酸脱氢酶法测定。1.2.3TUNEL法检测心肌细胞凋亡率心脏组织常规制作石蜡切片，脱蜡至水，利用生物素标记的dUTP(Biotin-dUTP）结合到切片中凋亡细胞DNA暴露的3′-OH端，随后和辣根过氧化物酶（HRP）标记的Streptavidin(Streptavidin-HRP）结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色，于显微镜下观察凋亡心肌细胞。每个样本随机选取5个高倍镜视野进行细胞计数，计算凋亡率。凋亡率=TUNEL阳性细胞/总细胞数×100%(2)1.2.4荧光定量PCR检测心脏基因表达水平采用Trizol法提取心脏总RNA，测定RNA纯度和浓度。按试剂盒说明书进行反转录反应，SYBRGreen法进行qRT-PCR，以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法分析Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA的相对表达量。1.3数据分析采用GraphPadPrism7.0软件进行统计分析，组间差异采用one-wayanalysisofvariance(ANO-VA）进行分析，Dunnett法进行多重比较检验。2、结果与分析2.1砷对小鼠心脏组织脏器系数的影响攻毒90d后，小鼠一般状况良好，各组小鼠全部存活，采食量和饮水量未见明显改变，毛色光亮，反应灵敏。从表1可以看出，不同浓度砷暴露组的小鼠心脏脏器系数均有所下降。其中，中剂量组与对照组相比差异显著（P<0.05），高剂量组与对照组间差异极显著（P<0.01）。表1不同浓度砷暴露对小鼠脏器系数的影响注：表中数据为平均值±标准误，n=10。*表示与对照组相比差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）。其余表同。2.2砷对小鼠血清心肌酶活力的影响表2不同浓度砷暴露对小鼠血清心肌酶活力的影响由表2可知，不同浓度砷暴露后，小鼠血清心肌酶活力与对照组相比，低剂量组各项指标无明显改变，中、高剂量组血清AST、LDH、CK、HBDH活力均显著升高，且随染毒剂量的增加而增加。2.3砷暴露对小鼠心肌细胞凋亡及凋亡通路基因表达的影响采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测不同处理对小鼠心肌细胞凋亡的影响，结果如图1所示。由图1可知，凋亡心肌细胞核呈棕黄至棕褐色，核形态为长椭圆形，胞质染色较浅。对照组中未发现有凋亡心肌细胞；低、中剂量组中偶见凋亡心肌细胞，多分布在心内膜、心外膜下，凋亡率分别为16.02%、10.64%；高剂量组凋亡心肌细胞的数量明显增加，凋亡率达到24.2%。采用荧光定量PCR方法检测了不同浓度砷暴露小鼠心脏凋亡通路相关基因的表达量，结果如图2所示。从图2可以看出，与对照组相比，中、高剂量组促凋亡蛋白调节因子Bax的表达显著升高，分别为对照组的1.24倍和1.31倍（P<0.05）。抗凋亡蛋白调节因子Bcl-2的基因表达量在中、高剂量组均显著降低，分别为对照组的88%(P<0.05）和62%(P<0.01）；高剂量组与低剂量组或中剂量组相比，表达量也显著降低，差异具有统计学意义。不同浓度砷暴露后，凋亡效应分子Caspase-3的基因表达均升高，低剂量和中剂量组的相对表达量分别增加了22%和18%，但差异不显著（P>0.05）；高剂量组Caspase-3的相对表达量增加了46%，差异显著(P<0.05）。3、结论与讨论3.1砷暴露对小鼠血清心肌酶活力的影响当心肌组织因多种原因发生炎症、坏死时，心肌细胞中所含的酶类即可进入血液中。因此，血液中心肌酶谱的水平可反映心肌损伤的程度[7,8]。心肌酶谱的测定主要包括：肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟基丁酸脱氢酶（HBDH）等[9]。CK主要存在于骨骼肌和心肌中，是心肌中重要的能量调节酶[10]。AST也是体内最重要的氨基转移酶之一，心肌中AST含量最为丰富[11]。血清CK、CK-MB、AST灵敏度和特异性均较高，已成为公认的反映心肌细胞损害的“金标准”[9]。LDH几乎存在于所有组织中，以心脏、骨骼肌和肾脏中含量最为丰富。LDH增高主要见于肝炎和心肌梗死等，其同工酶存在明显的组织特异性，可用于心肌疾病的诊断[12]。α-羟基丁酸脱氢酶（HBDH）的本质还是LDH，反映了以羟丁酸作为底物时的LDH1和LDH2的作用，其活力可持续14d或更长时间[13]。本试验中，1.50、15.00mg/LAs2O3暴露后，小鼠血清中AST、CK、LDH、HBDH的酶活力均显著增加，表明砷暴露对小鼠心肌造成特异性损伤，且随着染毒剂量的增加损伤程度加重。3.2砷暴露对小鼠心肌细胞凋亡的影响细胞凋亡是严格受到细胞信号调控的自主性消亡的过程[14,15]。凋亡通路核心分子家族成员有2个：Bcl-2家族和Caspase家族。Bcl-2家族成员中，有一类抑制凋亡的分子，以Bcl-2分子为代表[16]；还有一类促进凋亡发生的分子，以Bax分子为代表[17]。Caspase家族成员中，一类是凋亡启动分子，包括Caspase-2、8、9、10；另一类是凋亡效应分子，包括Caspase-3、6、7；还有一类Caspase的亚家族分子和凋亡的关系不大[18]。SUN等[19]研究发现，As2O3可显著抑制神经胶质瘤细胞抗凋亡基因Bcl-2的表达，并以时间依赖性方式上调凋亡基因Bax的表达，从而诱导细胞凋亡。细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，从而切断核小体间的DNA使其发生断裂暴露3′-OH，因此，可利用TUNEL法来检测细胞凋亡[20]。本试验研究发现，不同浓度砷暴露组中均可见TUNEL阳性凋亡心肌细胞，高浓度砷暴露组凋亡心肌细胞的数量明显增多。通过实时荧光定量PCR检测Bax、Bcl-2以及Caspase-3mRNA的表达，发现砷暴露上调了小鼠心肌组织中Bax及Caspase-3的表达，下调了Bcl-2的表达，表明亚慢性砷暴露可诱导小鼠心肌细胞发生凋亡。参考文献：[2]武晓英,乔宏萍,刘桂兰,等.硒对砷致雄性小鼠睾丸组织损伤的修复作用[J].山西农业科学,2020,48(4):551-555.[5]林元,庄凌梓,马宏,等.孕前/孕期砷暴露致胎鼠先天性心脏异常的研究[J].卫生研究,2016,45(1):93-97.[6]田晓琳.亚慢性砷氟暴露对大鼠心脏毒性的影响及自噬相关基因的表达变化[D].太原:山西医科大学,2019.[7]李军涛,田荣英.心肌酶谱､肌钙蛋白､肌红蛋白与脑钠肽联合检测在早期急性心肌梗死诊断中的临床价值[J].河北医药,2019,41(12):1779-1783.[9]肖四海,宋巧凤,王晓玲,等.心肌梗死患者心肌酶谱､急性生理和慢性健康评分与预后的相关性分析[J].中国临床医生杂志,2019,47(12):1438-1440.[10]刘国林,陶金忠,白玲荣,等.山楂和黄芪对围产期奶牛血液生化指标和免疫指标的影响[J].河南农业科学,2020,49(2):150-158.[12]谢田田.IL-33对缺氧/复氧所致心肌细胞程序性坏死的作用[D].杭州:江苏大学临床医学院,2018.[15]张慧慧,张晓燕,李妍妍,等.王俊东氟对大鼠睾丸支持细胞骨架蛋白mRNA的影响[J].山西农业科学,2017,45(4):557-560.[18]余莹华,徐志猛,曾昊,等.Caspase家族与固有免疫关系研究进展[J].中国药科大学学报(英文版),2019,50(5):622-630.李瑞华,韩明盛,胡鑫,马艳琴.亚慢性砷暴露对小鼠心肌细胞凋亡的影响[J].山西农业科学,2020,48(06):923-926.基金:山西省自然科学基金项目(201901D111232).