浅析雨生红球藻HaeDGAT2-3的分子克隆及生物信息学化石能源的过度开采以及煤炭、石油等的大量使用是造成化石能源枯竭、全球气候变暖的主要原因。温室效应的“罪魁祸首”CO2是植物光合作用所必需的底物材料，光合作用过程中，绿色植物可以在光能作用下，将所吸收的CO2和空气中的水分转化成碳水化合物并且释放出O2。微藻是一种诞生于亿万年前并且普遍存在于地球上的光合自养绿色植物[1]，它可以利用光合作用高效吸收CO2，并将其转化为对人类有益的高附加值活性成分，如高蛋白、多糖、虾青素和生物柴油等[2,3,4]。近年来，微藻由于其具有光合效率高、繁殖速度快、生长周期短等优点，被认为是解决能源危机和治理环境污染问题的最佳选择。三酰甘油（TAGs）是真核生物能量储存的主要形式，同时也是生物柴油原材料的理想来源[5]。植物体内的TAGs合成主要有2种途径：一种是乙酰辅酶A(acyl-CoA）依赖型，也称肯尼迪途径；另一种是不依赖于乙酰辅酶A的代谢途径[6]。其中，肯尼迪途径中TAGs的合成主要是在3种酰基转移酶的作用下将底物acyl-CoA顺序酰基化到甘油分子（Glycerol-3-phosphate)sn-1、sn-2、sn-3位点的过程[7]。这3种酰基转移酶依次为甘油三磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶和二酰甘油酰基转移酶[8]。其中，DGAT将酰基CoA上的酰基部分转移到二酰基甘油（DAG）的sn-3位置，从而完成TAGs的最终合成，是TAGs合成过程中的唯一关键限速酶[9,10]。目前，根据DGAT功能域、亚细胞定位等差异将其分为4种类型：DGAT1、DGAT2、DGAT3和WS/DGAT[11,12]。其中，DGAT1和DGAT2是结合在内质网上并编码内嵌于膜酯双分子层的微粒体酶，二者具有不同的拓扑结构；而DGAG3和WS/DGAT是最近刚发现的具有DGAT活性的酶，DGAT3是一种可溶性酶，WS/DGAT除了具有DGAT活性外还具有催化腊酯（Waxester）合成的活性[12,13]。雨生红球藻是一种单细胞真核绿藻，在胁迫条件下（如高温、高光和N胁迫等），雨生红球藻细胞形态由快速生长的绿色营养细胞转变为红色厚壁孢子状态[14,15]，此时虾青素在藻细胞内大量积累以抵御不良环境。天然虾青素具有极强的抗氧化性，抗氧化能力是维生素C的65倍，是β-胡萝卜素的54倍[16]。相较于其他产虾青素来源（红法夫酵母、南极磷虾等），雨生红球藻具有生长速度快、虾青素产量高（达细胞干质量的4%）等优点，是公认的天然虾青素的理想来源[17]；此外，其还可以有效清除氧自由基[17]，具有延缓衰老的功效，目前已被广泛应用于化妆品、食品等行业。雨生红球藻中虾青素主要以虾青素单酯和虾青素双酯的形式存在，少量以游离形式存在。有研究表明，雨生红球藻受到外界胁迫时，油脂含量会随之增加[18]。超微结构显示，雨生红球藻产生的虾青素酯在虾青素积累期储存于富含TAGs的油体中[18]。有研究表明[19],DGAT可能是催化虾青素酯化的关键酶。此外，莱茵衣藻、三角褐指藻和小球藻来源的DGAT都具有恢复DGAT缺陷型酵母H1246菌株合成三酰甘油能力的活性[20,21]。然而，雨生红球藻中的DGAT目前尚未见报道。本研究以同源克隆的方法获得雨生红球藻中DGAT基因，并利用生物信息学手段对其理化性质、高级结构和系统进化关系进行分析，以期为雨生红球藻虾青素酯化问题研究提供理论依据。1、材料和方法1.1试验材料1.1.1试验藻种及培养条件试验所用藻种为雨生红球藻Flotow1844（购自DunstaffnageMarineLaboratory），现保存于山西农业大学分子农业与生物能源研究所。所用藻种培养基为BG11培养基，藻种培养于人工气候培养箱，培养条件设置为温度（23±1）℃、光/暗周期12h/12h、白天光照强度1400lx，并且每8h摇晃一次。1.1.2试验设备研究所用仪器为：高压蒸汽灭菌锅PanasonicMLS-3781L（日本松下电器产业株氏会社）；超净工作台BoxunBJ-CD（上海博迅实业有限公司）；人工气候培养箱BIC-400（上海博讯实业有限公司）；电泳仪JY-SPCT（北京君意东方电泳设备有限公司）；凝胶成像仪、PCR仪BIO-RAD（伯乐生命医学产品（上海）有限公司）；分光光度计NanoDrop2000（美国赛默飞世尔科技公司）。1.2试验方法1.2.1总RNA的提取及cDNA的获得雨生红球藻总RNA通过TRizol法提取[22]，并根据所提取的雨生红球藻RNA的浓度利用反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT）获得cDNA模板。为避免实验过程中样品污染，操作人员应佩戴口罩及头套，所用离心管均为提取RNA专用离心管。另外，将所提取的RNA保存于-80℃冰箱。1.2.2同源克隆及RACE扩增对来自莱茵衣藻CC3491、小球藻ATCC30412以及三角褐指藻的DGAT2进行序列比对，从而获得高度保守序列；在此基础上，利用CODEHOP软件进行设计雨生红球藻DGAT2的2段同源克隆引物（F1、R1和F2、R2）。以获得的雨生红球藻cDNA为模板，按照TaKaRaLATaqR扩增体系进行PCR扩增，从而获得雨生红球藻HaeDGAT2-3的同源克隆片段。RACEcDNA模板的制备按照试剂盒说明书进行。在同源克隆片段的基础上获得5′端和3′端引物（5′RACER3、R4和3′RACEF3、F4）。以RACEcDNA为PCR扩增模板，以5′端和3′端引物为PCR扩增引物获得目的基因两端（5′端和3′端）的片段。通过DNAStarSeqMan软件对中间以及5′端和3′端RACE片段进行拼接获得雨生红球藻HaeDGAT基因cDNA序列全长，并据此设计表达框引物（F5、R5）。所用引物信息如表1所示，均由上海生工生物工程有限公司合成。表1引物信息1.3生物信息学分析雨生红球藻HaeDGAT2-3氨基酸序列是通过序列处理在线工具包（SMS)，将获得的HaeDGAT2-3的核苷酸翻译而来，开放阅读框的查找是通过在线ORFfinder软件对目的基因进行；通过在线软件ProtParam对雨生红球藻HaeDGAT2-3的理化性质进行分析；跨膜域及疏水区的预测是通过在线软件TMHMM及ProtScale进行；雨生红球藻HaeDGAT2-3及其他物种来源的DGAT2蛋白保守功能域通过NCBI的CCD在线软件进行预测；二级结构及三级结构的预测分别通过SOPMA和SWISS-MODEL进行；多序列比对是通过本地软件BioEdit进行分析；系统进化树是通过ClustalW软件进行序列比对，再通过本地软件MEGA7.0进行绘制，最终通过在线软件EvolView进行修饰。2、结果与分析2.1总RNA的提取和基因克隆结果分析由图1可知，泳道1从上往下依次是28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA等3个条带，其中，28SrRNA、18SrRNA条带带型清晰，5SrRNA条带较模糊，说明所提RNA质量较好；NanoDorp2000测定总RNA浓度是850ng/μL,A260/A280及A260/A230值分别为1.8～2.0和1.9～2.0，说明所提RNA质量较好，可进行后续试验；泳道2和3大小分别为482、773bp；泳道4和5大小分别为667、1149bp。2.2雨生红球藻HaeDGAT2-3蛋白cDNA序列分析雨生红球藻2型二酰甘油酰基转移酶DGAT2(HaeDGAT2-3）的cDNA序列全长是在同源克隆的基础上利用RACE(rapid-amplificationofcDNAends）技术获得，NCBI注册号为MN073496。如图2所示，HaeDGAT2-3序列全长为1446bp，编码区从248～1396bp共1149bp，编码383个氨基酸，其中，5′端非编码区（5′-UTR）和3′端非编码区（3′-UTR）长度分别为247、49bp。利用NCBI中的BLASTp程序对HaeDGAT2-3氨基酸序列进行比对分析，结果发现，HaeDGAT2-3基因与衣藻来源的DGAT2基因（NCBI检索号为GAX79066.1）相似性最大（54.02%），与小球藻、月牙藻来源的DGAT2基因（NCBI检索号分别为QBG05555.1、GBF91693.1）相似性分别达45.08%和41.82%。2.3雨生红球藻HaeDGAT2-3蛋白理化性质分析雨生红球藻HaeDGAT2-3蛋白基本理化性质通过在线软件ExPASY中的ProtParam工具进行分析，结果显示，该蛋白分子式为C1844H2824N486O489S17，分子质量为40.17ku，理论等电点为9.36，属于碱性蛋白。编码HaeDGAT2-3蛋白的20种氨基酸中丙氨酸（Ala）含量最高（13.3%）；其次为亮氨酸（Leu）和丝氨酸（Ser），含量分别为10.6%和7.6%；而色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）含量偏低，均为1.6%。说明该蛋白属于不稳定蛋白。在线分析软件ProtScale分析结果显示，HaeDGAT2-3蛋白存在至少3个疏水区，属于疏水蛋白。2.4雨生红球藻HaeDGAT2-3蛋白的高级结构分析雨生红球藻HaeDGAT2-3蛋白的二级结构通过在线软件SOPMA进行分析，结果显示（图3-A），目的蛋白中无规则卷曲所占比例最高（44.87%），其次为α-螺旋（32.88%），延伸链和β-折叠分别占18.75%和5.71%。图3-B为雨生红球藻DGAT2的三级结构预测结果，图3-C为三级结构所参照模型。雨生红球藻HaeDGAT2-3与其他不同来源DGAT2蛋白的保守域通过NCBI的在线工具进行预测，结果显示（图4-A），同其他来源的DGAT2相同，HaeDGAT2-3基因也有DGAT基因的典型LPLAT家族，暗示HaeDGAT2-3具有与其他来源DGAT2蛋白相似的功能；利用在线分析软件TMH-MMServer对雨生红球藻HaeDGAT2-3与其他不同来源DGAT2蛋白的跨膜域进行预测，结果显示（图4-B),HaeDGAT2-3蛋白在40—90位氨基酸区间内有2个明显的跨膜域；对其他来源DGAT2蛋白的跨膜域进行分析表明，DGAT2蛋白有1～3个跨膜域。此外，信号肽分析结果显示,雨生红球藻HaeDGAT2-3中无信号肽存在。图4中DGAT2序列相关信息如表2所示。表2DGAT基因名称及其登录号2.5雨生红球藻HaeDGAT2-3多序列比对分析通过本地软件BioEdit对HaeDGAT2-3氨基酸序列和其他来源的DGAT2进行比对分析，结果显示（图5),HaeDGAT2-3氨基酸序列中共包含7个保守的功能基序，分别为YFP、PH、PR、GGE、RGFA、VPFG和G基序。在YFP基序中，所有序列前2个氨基酸皆为YF，而只有HaeDGAT2-3、AtDGAT2、CzDGAT2D等7个序列在第3个氨基酸位置上为苯丙氨酸（Phe）；在PH基序中，只有CzDGAT2D、CrDGAT2D、AtDGAT2和GmDGAT2等4个序列第3个氨基酸位置上的甘氨酸（Gly,G）被丝氨酸（Ser,S）所取代，暗示这4个氨基酸序列在功能上相似；在PR基序中，雨生红球藻来源的HaeDGAT2-3氨基酸序列同高等植物来源的DGAT(AtDGAT2和GmDGAT2）在第1个位置上的氨基酸保持一致，第2个位置上的氨基酸在所测试序列中散乱分布，只有氨基酸序列相对特殊的微拟球藻来源的NoDGA-T2K在第4个位置上的氨基酸是甘氨酸（Gly,G），其余全都是精氨酸（Arg,R）；在GGE基序中，所有序列都含有完整的GGE基序，但是在2个位置上的氨基酸并不保守，而只有CzDGAT2D、CrDGAT2D、AtDGAT2和GmDGAT2这4个氨基酸序列在这2个位置上的氨基酸保持一致，再一次暗示其功能相似；在基序RGFA中，雨生红球藻HaeDGAT2-3异亮氨酸（Ile,I）替换了苯丙氨酸（Phe,F），这可能是造成功能差异的关键原因；VPFG基序相比其他基序有很大的差异性，相对不保守；在基序G中，所有氨基酸序列都有完整的G基序，相对保守。从图5的分析结果可以看出，HaeDGAT2-3与CrDGAT2A、CzDGAT2A和CzDGAT2B可能具有相同的功能。2.6雨生红球藻HaeDGAT2-3的系统进化分析为进一步研究雨生红球藻来源的HaeDGAT2-3与其他来源DGAT的进化关系，从NCBI数据库以及已发表的文献中搜集到53条DGAT序列，包括微藻、菌类和高等植物来源的DGAT1s、DGAT2s、DGAT3s和WS/DGATs等4种不同类型的二酰甘油酰基转移酶，在序列比对的基础上对其进行系统进化分析，结果显示（图6),4种不同类型的DGATs分别聚为一支，而且微藻、菌类和高等植物来源的DGAT在各自的类群中明显分开；值得注意的是，HaeDGAT2-3与CrDGAT2A、CzDGAT2A和CzDGAT2B聚为一个小支，暗示它们具有相同的功能，进一步验证了多序列比对的预测结果。图6进化树所有序列的相关信息列于表2。3、结论与讨论雨生红球藻是一种单细胞绿色微藻，被认为是天然虾青素的理想来源[5]，并且其产生的虾青素以虾青素单酯和虾青素双酯的形式存储于富三酰甘油（TAGs）的油体中。二酰甘油酰基转移酶（DGAT）是依赖于乙酰辅酶A(acyl-CoA）合成TAG的肯尼迪途径中催化TAG生物合成最后一步的关键限速酶[9,10]，目前，已有大量来源于不同物种（包括高等植物、微藻和真菌）的DGAT被用来探究DGAT的表达与脂肪酸含量及成分的变化关系，研究发现，高等植物中续随子来源的EiDGAT2基因可以提高烟草叶片中的总脂含量[23]，紫苏来源的PfDGAT1被发现可以恢复TAG缺陷型酵母H1246重新合成油脂的能力[24]；高山被包霉来源的MaDGAT基因以及毛霉菌来源的McDGAT基因被证实具有恢复H1246合成油脂的能力，但它们有着不同的底物偏好性[25,26]；此外，莱茵衣藻、微拟球藻、三角褐指藻等微藻来源的DGAT也相继被发现具有催化TAG合成的能力[5,21,27]。然而，雨生红球藻来源的DGAT2并未见报道。本研究通过同源克隆方法获得了雨生红球藻DGAT2的同源片段及同源克隆引物，并在此基础上通过RACE扩增技术获得雨生红球藻HaeDGAT2-3的cDNA序列全长1446bp，编码383个氨基酸，其中，丙氨酸（Ala）含量最高，为13.3%。此外，雨生红球藻HaeDGAT2-3蛋白分子质量为40.17ku，理论等电点为9.36。二级结构分析结果显示，无规则卷曲所占比例最高，为44.87%。根据NCBI中的BLASTp分析结果显示，雨生红球藻来源的DGAT2与莱茵衣藻、小球藻和月牙藻来源的DGAT2相似性均在40%以上，分别达54.02%、45.08%和41.82%，说明其功能具有相似性。DGAT1s和DGAT2s虽然在分子结构上有很大的差异，属于2个不同的基因家族，但在功能水平上却是一致的。DGAT1s一般具有8～9个跨膜域，而DGAT2s中跨膜域相对较少，一般为1～3个。比如，紫苏、小球藻来源的DGAT1都有9个跨膜螺旋区[27,28]，续随子来源的DGAT2有2个跨膜区[24]。本研究发现，HaeDGAT2-3蛋白具有2个跨膜区，符合DGAT2家族序列特点。保守域分析结果显示，雨生红球藻来源的DGAT2具有同其他DGAT2来源相同的LPLAT家族。此外，本研究对HaeDGAT2-3与微藻、高等植物和细菌来源的DGAT进行多序列比对，结果表明，同其他物种来源的DGAT2相同，HaeDGAT2-3也具有7个功能域；在这7个功能域中，YFP、RGFA和VPFG基序的保守性较低。同时，CzDGAT2D、CrDGAT2D、AtDGAT2和GmDGAT2这4个氨基酸序列具有很高的相似性。值得注意的是，在第5个基序RGFA中，HaeDGAT2-3蛋白中异亮氨酸（Ile,I）替换了苯丙氨酸（Phe,F），暗示HaeDGAT2-3基因可能具有不同的功能。系统进化分析结果表明，HaeDGAT2-3基因确实属于DGAT2家族，并且与CrDGAT2A、CzDGAT2A和CzDGAT2B聚为同一个小支，暗示其具有相同的功能。本研究在同源克隆的基础上利用RACE扩增技术首次获得了雨生红球藻中2型二酰甘油酰基转移酶DGAT2的cDNA序列全长，并利用生物信息学方法对其进行分析，结果显示，HaeDGAT2-3蛋白分子式为C1844H2824N486O489S17，分子质量为40.17ku，编码区全长1149bp，共编码383个氨基酸。功能域分析表明，其可能具有催化TAG合成的功能。同其他来源的DGAT2相同，HaeDGAT2-3也具有7个保守的功能域，而在RGFA基序中，HaeDGAT2-3表现出一定的特异性，暗示其功能可能不尽相同。进化树分析结果表明，其与已经报道的具有TAG合成功能的DGAT2相似性极高，暗示其可能亦具有合成TAG的功能。本试验结果可为进一步了解雨生红球藻中虾青素酯化机制提供参考。参考文献：[1]李润植,季春丽,崔红利.微藻生物技术助力功能农业[J].山西农业大学学报(自然科学版),2018,38(3):1-12,77.[2]赵熙宁,张飞,岳敏,等.籽粒苋优质贮藏蛋白AhAMA1基因功能分析[J].山西农业科学,2019,47(5):27-33.[3]陈玮,刘启顺,李曙光,等.微藻多糖生物活性研究进展[J].中国海洋药物,2012(3):59-64.[4]李林品,张勇,吴秋瑾,等.不同培养模式对雨生红球藻细胞绿色生长以及虾青素积累的影响研究[J].科技风,2019(25):224-225.[11]唐桂英,柳展基,单雷.二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)研究进展[J].中国油料作物学报,2010(2):150-158.[14]刘建国,殷明焱,张京浦,等.雨生红球藻的细胞周期初探[J].海洋与湖沼,2000,31(2):145-150.[15]张宝玉,李夜光,李中奎,等.温度､光照强度和pH对雨生红球藻光合作用和生长速率的影响[J].海洋与湖沼,2003,34(5):558-565.[17]崔红利,陈军,王林萍,等.雨生红球藻PHOT的基因克隆和生物信息学分析[J].西南农业学报,2017,30(12):29-37,251.[22]张宏江,杭伟,马浩天,等.雨生红球藻UVR8的基因克隆和生物信息学分析[J].西南农业学报,2019,32(9):2025-2032.[23]任国鹏,葛丽萍,孙超超,等.续随子二酰甘油酰基转移酶2基因(ElDGAT2)克隆与功能分析[J].植物生理学报,2019,55(8):1156-1166.[24]王计平,周雅莉,任文燕,等.紫苏PfDGAT1酵母功能互补分析[J].山西农业大学学报(自然科学版),2019,39(5):10-15.[28]周雅莉,任文燕,郝月茹,等.紫苏二酰甘油酰基转移酶基因(PfDGAT1)鉴定及表达分析[J].山西农业科学,2019,47(5):701-705.张宏江,赵春超,许文鑫,杭伟,崔红利,李润植.雨生红球藻HaeDGAT2-3的分子克隆和生物信息学分析[J].山西农业科学,2020,48(05):669-676.
