TOR逆转肺癌耐药细胞株A549cDDP耐药性的应用肺癌是临床上比较常见的恶性肿瘤之一,目前临床对其治疗主要手段之一为化疗,但对于化疗周期较长的患者来讲,可能出现癌细胞对治疗药物产生一定的抗药性,直接影响化疗效果[1,2,3,4]。因此临床对于能否应用药物来改善癌细胞对治疗药物的敏感性,并逆转耐药性是临床比较关注的问题。相关研究指出,通过托瑞米芬(TOR)的应用,可增加多种肺癌耐药细胞株的敏感度,并对其产生逆转作用[5,6,7],本文拟分析TOR对耐顺铂(CDDP)细胞株A549的逆转作用。1、资料与方法1.1实验材料肺癌耐药细胞株A549/cDDP:使用大剂量的cDDP连续冲击12次以上后获得,冲击后经四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测后显示其耐药指数为4.2。枸橼酸TOR:生产厂家为福安药业集团宁波天衡制药有限公司,国药准字H20020047。CDDP:生产厂家为齐鲁制药有限公司。AnnexinV/PI双染色细胞凋亡检测试剂盒、IMDM培养基、二甲基亚砜及MTT均购于上海钰博生物科技有限公司。1.2TOR母液的配置方法称取枸橼酸TOR2.99g,将其与5ml二甲基亚砜进行充分溶解,并加入无血清IMDM5ml,混合均匀后即得到500μmol/L的TOR母液。对其进行除菌、分装后在常温下保存,并避免阳光照射。1.3MTT检测应用MTT法检测TOR联合cDDP及单纯应用cDDP对肺癌耐药细胞株A549/cDDP药物敏感性的影响。首先将选定的A549/cDDP菌株进行复苏处理并培养,当其达到指数生长期后,对其使用胰蛋白酶(0.25%)进行消化处理,然后使用生理盐水进行洗涤,洗涤后计数。取胎牛血清IMDM培养液(体积分数为10%)配置成单个细胞悬液(5×104ml),将其接种于96孔培养板中,100μl/孔,将其放置在浓度为5%的CO2培养箱中,温度保持在37℃,在此种环境下放置一夜,保持其生长,当细胞壁贴壁时即代表生长较好。将其分为单独cDDP组、5μmol/LTOR联合cDDP组及10μmol/LTOR联合cDDP组,其中单独cDDP组浓度分别为200、100、50、20、10、5μmol/L。以上各种药物浓度均设置4个复孔,并设置阴性对照组、阳性对照组、5μmol/LTOR对照组及10μmol/LTOR对照组,其中阳性对照组中含有1%的二甲基亚砜,阴性对照组为等体积的无血清二甲基亚砜。然后加入受试药物cDDP,最后的浓度为200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、20μmol/L、10μmol/L及5μmol/L;将浓度为5μmol/L和10μmol/L的TOR放置在饱和湿度,温度为37℃及5%CO2的环境下进行静止培养,培养时间为68h,然后加入浓度为5mg/ml的MTT20μl/孔,继续培养4h,培养满72h后去除上清液,同时加入二甲基亚砜15μl/孔,充分震荡10min后,观察结晶全部溶解后使用全自动酶标仪检测各孔吸光度值(A),波长为492nm。1.4计算公式药物对细胞抑制率=阳性对照孔A-加药孔A/阳性对照孔A×100%。半数抑制浓度(IC50)根据曲线方程求得。逆转倍数=cDDPIC50/(cDDP+TOR)IC50。1.5使用流式细胞仪检测cDDP及cDDP+TOR联合用药诱导肺癌耐药细胞株A549/cDDP采用AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡和药物浓度,所有操作严格按照试剂盒说明展开,采用CoulterXL-MCL流式细胞仪收集细胞,每个样本均收集10000个细胞。1.6统计学分析采用SPSS17.0统计学软件进行t和χ2检验。2、结果2.1MTT比色试验结果当单独TOR浓度为5μmol/L和10μmol/L时,其对于A549/cDDP细胞的增殖未造成明显影响(P>0.05);当TOR和cDDP共同应用时,5μmol/L和10μmol/L浓度均能提高cDDP对于A549/cDDP细胞的敏感性,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。表1TOR联合cDDP及单独应用cDDP对肺癌耐药细胞株A549/cDDP药物敏感性的影响2.2cDDP+TOR联合用药逆转肺癌耐药细胞株A549/cDDP对cDDP的耐药性cDDP浓度为200、100、50、20、10、5μmol/L时均可抑制A549/cDDP细胞,且随着浓度的上升,其抑制程度也会增加。当cDDP与TOR联合应用时,cDDP浓度为10μmol/L或者5μmol/L,均可提升cDDP对于A549/cDDP细胞的敏感性,差异有统计学意义(t=8.879,P=0.002),IC50值为39.04μmol/L时,其逆转倍数为2.04倍,IC50值为30.61μmol/L时,其逆转倍数为2.61倍当cDDP浓度为200μmol/L时,cDDP+TOR终浓度5μmol和cDDP+TOR终浓度10μmol/L之间存在统计学意义(t=8.657,P=0.000),其他浓度时无统计学意义(P>0.005)。cDDP+TOR终浓度5μmol/L与cDDP+TOR终浓度10μmol/L之间仅在cDDP浓度为200μmol/L时两者差异有统计学意义(t=2.965,P=0.006)。见图1。图1为TOR逆转cDDP对A549/cDDP抑制曲线3、讨论随着人们生活习惯及生活环境的改变,罹患肺癌的人群越来越多,非小细胞肺癌(NSCLC)作为最为常见的肺癌类型具有较高的死亡率。在既往研究中指出,NSCLC具有天然的耐药性,且耐药群体比较广,在化疗过程中经常会出现癌细胞对化疗药物耐药的情况出现,这直接导致化疗效果下降,影响治疗效果[5,7]。针对此问题临床很多学者均进行了研究,且指出NSCLC患者的癌细胞组织中雌激素受体(ER)水平相对较高,且ER水平的高低及其阳性表达率与肺癌的分化程度有一定关系,同时与组织学类型也有着密切的关系[8,9,10,11]。TOR是ER的拮抗剂,其在1979年研制出的一种抗肿瘤药物。其与传统的拮抗剂相比,在治疗肿瘤方面具有毒性小,副作用少的作用,同时还具有不致癌、不致畸的特点,当其与化疗药物联合应用时,其可以逆转药物耐药作用,增加抗肿瘤药物的敏感性[8,9,10]。相关研究指出,TOR的逆转药物耐药作用及增加抗肿瘤药物的敏感性[11,12,13],其主要机制如下:(1)TOR在机体的代谢中发挥了很大作用,作用之一即抑制蛋白激酶C的活性,同时还会降低P糖蛋白的活性及降低磷酸化水平,在此种作用下使其逆转肺癌的多种药物耐药。(2)肺癌组织具有一定的特点,临床显示此类患者的ER均呈高表达状态,TOR和ER结合对于已经产生激素依赖的肺癌组织产生了明显的抑制作用[14,15]。ER是一种Ca2+,同时也是磷脂依赖性蛋白激酶,其直接参与了癌细胞的分化、增殖过程,并起到了重要作用,同时也会对P-gp和MDR1基因造成一定的影响。TOR作为ER抑制剂其较高的化学活性降低了P-gp磷酸化水平,达到逆转耐药的作用。同时,PKC也可促使Topo和LRP的磷酸化,当PKC活性增加后介导了多药耐药,此种途径也是TOR发挥逆转耐药作用的渠道之一。(3)TOR对Ca2+具有双向调节的作用,对于高浓度的TOR可以诱导肿瘤细胞凋亡。在细胞信号传递过程中,Ca2+发挥了重要作用,其涉及细胞内广泛的生物学效应。当Ca2+水平上升时,可激活系列Caspase胞质内蛋白酶和核酸内切酶门降解DNA,促使细胞凋亡。相关研究指出,耐药细胞系A549/cDDP细胞内的Ca2+浓度与敏感细胞系A549相比相对较低,TOR对于Ca2+具有双向调节的作用,高浓度的TOR可以促进Ca2+浓度的上升,促使细胞出现死亡。本研究说明,治疗时使用5μmol/L剂量可以达到化疗增敏和逆转作用,降低大计量应用导致的毒副作用,对于临床用药有一定的指导意义。综上,TOR联合cDDP应用时,可以有效提升A549/cDDP的转录和治疗效果,避免了大剂量使用可能带来的毒副作用。参考文献：[1]赵洁婷.microRNA-21促进人肺腺癌细胞A549对顺铂耐药性的研究[J].安徽医药,2017;21(6):1082-6.[2]侯海金.表观遗传学在肿瘤中的作用[J].中华临床医师杂志(电子版),2016;10(18):2780-4.[3]陈恒屹.组蛋白去乙酰化酶抑制剂与肿瘤治疗研究进展[J].重庆医学,2017;46(30):4280-2.[4]娄诚,GongF,杜智.肿瘤表观遗传学治疗研究进展[J].世界华人消化杂志,2017;25(12):1072-3.[5]邱英,周娟,杜豆.非小细胞肺癌劳拉替尼获得性耐药细胞株的建立及耐药后治疗策略[J].实用医学杂志,2019;35(11):1722-6.[6]钱文良,郑敏.EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌的诊疗进展[J].临床外科杂志,2016;24(7):518-20.[7]丁晓艳,韩福才.采用克唑替尼治疗EML4-ALK阳性的晚期非小细胞肺癌的研究[J].现代养生,2016;11(3):122-3.[8]陈瑞琳.克唑替尼靶向治疗非小细胞肺癌疗效及EML4-ALK的表达情况分析[J].临床肺科杂志,2018;23(1):149-52.[9]卢小妹,付杰军.E-钙黏蛋白在人非小细胞肺癌细胞多西他赛耐药中的作用[J].现代肿瘤医学,2019;27(10):1683-9.[10]杨学亮,刘阳.多西他赛用于非小细胞肺癌化疗的研究进展[J].山西职工医学院学报,2017;27(2):65-7.[11]张余飞.非小细胞肺癌上皮间质转化与靶向药物耐药关系的研究进展[J].癌症进展,2016;14(3):220-2.[12]张汀荣.CTEN､TGF-β1和E-钙黏蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义[J].江苏医药,2016;42(16):1772-5.[13]钱琳.晚期非小细胞肺癌患者进行单药多西他赛二线治疗的临床研究[J].临床医药文献电子杂志,2018;5(15):105-6.[14]黄英连.多西他赛联合顺铂治疗晚期非小细胞肺癌的临床观察[J].基层医学论坛,2016;20(9):1194-5.[15]宋德刚.多西他赛联合顺铂对中晚期非小细胞肺癌疗效分析[J].临床医药文献电子杂志,2019;6(40):74-5.顾晶晶,张敬毅,孙平,田桂珍.托瑞米芬逆转肺癌耐药细胞株A549/cDDP耐药性的应用[J].中国老年学杂志,2020,40(17):3753-3755.
