高粱不同连作年限根际土壤微生物代谢功能多样性探究高粱（SorghumbicolorL.Moench）是世界上第五大谷类作物，具有多重抗逆性[1]，是一种重要的旱地杂粮作物，也是山西老陈醋和汾酒的主要酿造原料，受到镰刀湾种植结构调整拉动，高粱成为山西旱作农业可持续发展的重要作物[2]。连作都会导致植物病原体富集，土壤微生态环境恶化[3]，最终降低作物产量[4]。随着高粱订单农业的发展，种植企业为追求经济效益，长期高强度连续种植高粱，出现连作障碍现象。因此，高粱连作障碍成为制约山西省高粱可持续发展的关键问题。根际是植物与土壤细菌和真菌共生的特殊微生态环境，植物根系分泌物可选择性地促进或抑制特定微生物类群[5]，土壤微生物类群的变化会影响土壤微生态功能的改变[6]。近年来，有学者研究认为，根际微生态系统的失衡是造成连作障碍发生的主要原因[7,8]。植物根际微生物群落较为敏感和迅速地反映根际环境条件的变化，是根际微生态的重要组成部分[9]，因此，研究连作根际土壤微生物的变化规律很有必要。邹春娇等[10]对不同连作年限黄瓜基质微生物群落结构多样性研究发现，在连作5茬时，栽培基质中微生物碳代谢活性、功能多样性均高于各茬，但在连作11茬后，基质中微生物碳代谢活性、功能多样性均显著降低，但对羧酸类碳源的代谢明显升高。秦舒浩等[11]对马铃薯连作障碍的研究发现，随连作年限不同，马铃薯连作根际土壤微生物群落结构代谢多样性及遗传多样性发生改变，但不同作物在不同连作年限条件下土壤微生物群落结构变化特征有所差异[12]。已有研究表明，连作导致高粱长势及产量降低，连作根际土壤真菌富集，土壤微生态环境恶化[3,13,14]。但目前不同连作年限条件下，连作高粱根际土壤微生物群落结构变化的相关研究国内外尚未见报道。本研究以高粱连作根际土壤为研究对象，采用BIOLOG-ECO板对根际土壤微生物群落的碳源代谢功能进行分析，从功能多样性角度揭示了高粱根际土壤微生物群落变化，以期为深入研究高粱根际土壤生态功能及高粱连作障碍机制提供一定的理论参考。1、材料和方法1.1试验地概况本试验于2017年4—7月在山西省农业科学院连栋温室内进行，采用盆栽试验方法，供试土壤采集于山西省农业科学院试验基地高粱连作5a田、高粱连作10a田、高粱玉米轮作田，多点采集耕作层0～20cm土壤并充分混匀。盆栽土的基础理化性质如下：pH=8.40，有机质14.16g/kg，全氮0.98g/kg，速效磷8.17mg/kg，速效钾259.82mg/kg。1.2试验材料供试高粱品种为山西省农业科学院高粱研究所选育的晋杂34号。1.3试验设计盆栽试验设置3个处理：C5（高粱连作5a）、C10（高粱连作10a）、CK（高粱玉米轮作）；每处理设置6个重复，共18盆。每盆装土5kg（盆高18cm，盆内径21cm），装盆前将肥料与不同处理土壤充分混匀（施N肥0.2g/kg,P肥0.15g/kg,K肥0.15g/kg），播种前将种子催芽，每盆播20粒，留苗4株到抽穗期。在出苗60d后破坏性取土样，抖根法[15]采集高粱根际土壤，根际土壤去除杂质后立即保存于-80℃，用于测定微生物功能多样性。1.4测定项目及方法1.4.1作物生长参数的测定在出苗后60d，破坏性采集高粱植株样本，测定高粱株高、茎粗，并烘干测其生物量。1.4.2土壤微生物群落结构的测定土壤微生物功能多样性使用BIOLOG-ECO微平板法测定[16]。称取相当于10g干土质量的根际土壤加入100mL灭菌的NaCl溶液（0.85%）中，得到10-1土壤浸提液；200r/min旋涡振荡30min；静置片刻后梯度稀释到10-3土壤浸提液，土壤按照每孔150μL加入ECO板，加盖放置于28℃的培养箱中培养至168h，每隔24h在590nm下测定吸光值（BiologReader4.2）。每孔平均颜色变化率（AWCD)[17]用于描述土壤微生物代谢活性，BIOLOG-ECO板的31种碳源可分为六大类，即碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类、多聚物类、酚酸类、胺类，计算每类碳源对应孔吸光值的平均值，用来表征微生物群落对该类碳源的代谢活性；McIntosh指数（U）、Shannon-Wiener指数（H）为分别用于描述土壤微生物群落均匀度及丰富度的指数[18]。公式1公式2公式3公式4式中，Ci为第i孔的吸光值，R为空白孔的吸光值。1.5数据处理采用MicrosoftExcel2013进行数据整理；用BIOLOG-ECO板培养96h的数据进行分类碳源利用及主成分分析，采用SPSS17.0进行不同处理间数据的方差分析及主成分分析。2、结果与分析2.1不同连作年限对高粱生长的影响由表1可知，与CK相比，C5和C10显著抑制了高粱的生长，C5处理高粱的株高、茎粗和生物量分别比CK降低了10.18%、15.73%、14.62%，差异达显著水平（P<0.05),C10处理高粱的株高、茎粗和生物量分别比CK降低了21.28%、15.73%、28.46%，差异达显著水平（P<0.05）；比较不同连作年限条件下高粱生长特征可知，C10对高粱生长的抑制作用比C5的抑制作用更大，C10高粱长势最弱。由此可得，连作显著抑制高粱生长，连作10a对高粱的抑制作用大于连作5a。表1不同连作年限高粱的生长情况2.2不同连作年限对高粱根际土壤微生物代谢活性及功能多样性的影响AWCD（每孔平均颜色变化率）反映土壤微生物对31种碳源的平均利用能力，可表征高粱根际土壤微生物群落的代谢活性。随着培养时间的延长，根际微生物对碳源代谢能力逐渐增加，到168h时逐渐趋于平缓，在培养过程中，C10的AWCD值均显著高于C5和CK处理，而C5的AWCD值低于CK处理（图1）。在培养96h时，C10的AWCD值分别是C5和CK的2.05倍、1.47倍（P<0.05),C5的AWCD值比CK降低了28.57%(P<0.05）（表2）。这表明，连作5a降低了高粱根际土壤微生物代谢活性，而连作10a增加了根际土壤微生物的代谢活性。表2不同连作年限高粱根际土壤微生物群落的功能多样性指数对培养96h数据进行碳源代谢多样性分析，结果显示，C10的McIntosh指数分别是C5、CK的2.08倍、1.45倍（P<0.05),Shannon多样性指数分别比C5、CK处理增加了2.74%、4.17%(P<0.05）。C5的McIntosh指数比CK降低了30.15%(P<0.05），但C5的Shannon多样性指数与CK相比差异不显著。这表明连作10a高粱根际土壤微生物群落对碳源代谢的多样性及均匀性显著增加，但连作5a时高粱根际土壤微生物群落代谢活性及代谢均匀性降低，但代谢碳源的多样性差异不大（表2）。2.3不同连作年限对高粱根际土壤微生物群落分类碳源代谢活性的影响根据官能团的不同，可将BIOLOG-ECO板的31种碳源分为6大类，C10对碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类的代谢分别是CK的1.63倍、1.53倍、2.62倍，差异达显著水平（P<0.05），而C10对多聚物类、酚酸类、胺类的代谢与CK处理差异不显著。与CK相比，C5对碳水化合物类、氨基酸类、多聚物类、酚酸类、胺类的代谢均显著降低，而C5对羧酸类的代谢比CK显著增加，其对羧酸的代谢活性是CK的2.48倍（P<0.05）。这表明，连作10a增加了高粱根际微生物对碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类的利用能力，而连作5a增加了高粱根际微生物对羧酸类的利用能力，但对其余5类碳源的利用能力均降低（表3）。表3不同连作年限高粱根际土壤微生物群落的分类碳源代谢活性不同处理根际土壤微生物对31种碳源代谢的值进行热图聚类分析（图2），与CK相比，C5降低了对碳水化合物类（B3,D-GalacturonicAcid、E2,N-Acetyl-D-Glucosamine、D2,D-Mannitol、F2,D-GlucosaminicAcid）、氨基酸类（B4,L-Asparagine）、多聚物类（C1,Tween40）的代谢能力，但C5增加了对羧酸类（H3,D-MalicAcid）的代谢能力；C10增加了对碳水化合物类（B2,D-Xylose、H1,a-D-Lactose、G1,D-Cellobiose、A2，β-Methyl-D-Glucoside）、羧酸类（H3,D-MalicAcid）的代谢能力。2.4不同连作年限高粱根际土壤微生物群落碳源利用能力的主成分分析图3中连接原点和碳源的向量长度可度量微生物碳源代谢能力差异的贡献值，向量越长表示该碳源对微生物代谢差异的贡献值越大。从图3可以看出，C5和C10在PC1上分异较大，而CK在PC2上与C5、C10分异较大；碳水化合物类（CB）对各处理分异贡献最大，其次为多聚物类（PO）、氨基酸类（AA）、羧酸类（CA）。3、结论与讨论在农业生产中，多种作物都会出现连作障碍现象[15,19,20]。LIU等[19]报道，随着大豆连作年限的延长，大豆产量逐年下降。XIONG等[20]研究表明，长期连作显著影响黑胡椒长势。已有研究表明，高粱不耐连作，连作3a后高粱生长和产量明显下降[13]，且随着连作年限的增加，高粱单株产量、单株干物质量持续降低[21]。本研究也证实了这一结论，与轮作对照相比，连作高粱长势减弱，连作10a高粱株高、茎粗和生物量均显著低于连作5a。根际是植物-土壤-微生物相互作用的中心，根际土壤微生物可敏感反映土壤环境的变化[22]。BIOLOG-ECO微平板法可以从微生物碳源代谢角度，反映土壤微生物代谢活性及代谢功能多样性[10]。本研究显示，相比轮作，高粱连作5a时根际土壤的AWCD值、功能多样性指数降低，而连作10a时AWCD值、功能多样性指数升高，但不同连作年限都显示出对羧酸类代谢能力增加。岳冰冰等[23]对连作7a烟田土壤微生物功能多样性的研究表明，连作明显降低了烟田土壤微生物碳源利用能力，烤烟连作后土壤微生物代谢活性及功能多样性降低。已有研究表明，烤烟连作后土壤中真菌比例显著增加，破坏了土壤微生物群落结构的平衡[24]，随烤烟连作年限的增加细菌多样性指数呈下降趋势，真菌多样性指数有上升趋势[25]。对马铃薯、黄瓜连作土壤细菌群落结构的研究也有相似结论，随着连作年限的增加，细菌群落结构多样性和丰富度持续下降。孟品品等[26]研究发现，连作马铃薯会增加土壤中真菌类病原菌镰刀菌。然而基于不同作物，不同连作年限土壤微生物群落多样性的变化也有不同报道。朱琳等[27]对大豆不同连作年限的研究表明，连作10a以上大豆土壤微生物群落的丰富度和多样性增加。刘株秀等[28]的研究也有一致规律，与大豆、玉米轮作体系相比，连作13a大豆土壤微生物群落丰富度和多样性显著高于连作3a和连作5a。寇智瑞等[29]对不同连作年限黄壤烟田土壤细菌群落的研究发现，烟田连作5a内土壤微生物群落多样性和丰富度逐渐上升，连作5a时微生物群落丰富度最高，烟田连作8a后土壤微生物群落丰富度与植烟1a相比显著降低，随连作年限的增加，微生物丰富度下降更加明显。本研究表明，随连作年限的增加，高粱根际土壤中微生物的代谢活性及代谢功能多样性呈现先降低后升高的趋势，且不同连作年限都表现出对D-苹果酸的代谢活性增加，造成这一现象的原因可能与高粱根际土壤微生物群落结构变化及高粱独特的根系分泌物有关。随着高粱连作年限的增加，土壤中真菌类有害菌群富集[14]，打破了土壤微生态平衡，进而降低土壤微生物群落的代谢活性，但随着连作年限的增加，根系分泌物烃类和酯类化合物逐渐增加[21]，可能促进代谢此类物质的微生物繁殖，并在高粱根际逐年富集。本研究中，连作高粱根际对羧酸类代谢增加，也间接佐证了这一观点。综上所述，连作导致高粱长势减弱，根际土壤微生物代谢活性及功能多样性发生变化，随着连作年限的增加，作物长势受到的抑制作用增加，但高粱根际土壤微生物代谢多样性呈现先下降后上升的趋势。本研究采用BIOLOG-ECO技术从代谢角度研究不同连作年限条件下高粱根际土壤微生物群落结构的变化，下一步仍需借助分子生物学方法明确连作年限的变化、根际土壤微生物的基因多样性的变化以及根系分泌物富集哪些关键微生物菌群，探究高粱连作障碍机制。参考文献：[2]邹剑秋,王艳秋,柯福来.高粱产业发展现状及前景展望[J].山西农业大学学报(自然科学版),2020,40(3):2.[10]邹春娇,齐明芳,马建,等.Biolog-ECO解析黄瓜连作营养基质中微生物群落结构多样性特征[J].中国农业科学,2016,49(5):942-951.[11]秦舒浩,曹莉,张俊莲,等.轮作豆科植物对马铃薯连作田土壤速效养分及理化性质的影响[J].作物学报,2014,40(8):1452-1458.[12]许自成,王发展,金伊楠,等.不同连作年限烤烟根际土壤真菌群落18SrDNA-PCR-DGGE分析[J].中国土壤与肥料,2019(4):39-46.[13]王劲松,樊芳芳,郭珺,等.不同作物轮作对连作高粱生长及其根际土壤环境的影响[J].应用生态学报,2016,27(7):2283-2291.[14]樊芳芳,王劲松,董二伟,等.连作对高粱生长及根区土壤环境的影响[J].中国土壤与肥料,2016(3):127-133.[15]华菊玲,刘光荣,黄劲松.连作对芝麻根际土壤微生物群落的影响[J].生态学报,2012(9):312-318.[16]高明霞,孙瑞,崔全红,等.长期施用化肥对塿土微生物多样性的影响[J].植物营养与肥料学报,2015,21(6):1572-1580.[21]李光,白文斌,任爱霞,等.高粱不同连作年限对其根系分泌物组成和化感物质含量的影响[J].生态学杂志,2017,36(12):3535-3544.[22]李兰君,刘玳含,刘建斌,等.连作对设施番茄土壤微生物及酶活性的影响[J].江苏农业科学,2018,46(18):138-142.[23]岳冰冰,李鑫,张会慧,等.连作对黑龙江烤烟土壤微生物功能多样性的影响[J].土壤,2013,45(1):116-119.[24]李鑫,张秀丽,孙冰玉,等.烤烟连作对耕层土壤酶活性及微生物区系的影响[J].土壤,2012,44(3):456-460.[25]高林,王新伟,申国明,等.不同连作年限植烟土壤细菌和真菌群落结构差异[J].中国农业科技导报,2019,21(8):147-152.[26]孟品品,刘星,邱慧珍,等.连作马铃薯根际土壤真菌种群结构及其生物效应[J].应用生态学报,2012,23(11):3079-3086.[27]朱琳,曾椿淋,李雨青,等.基于高通量测序的大豆连作土壤细菌群落多样性分析[J].大豆科学,2017,36(3):419-424.[28]刘株秀,刘俊杰,徐艳霞,等.不同大豆连作年限对黑土细菌群落结构的影响[J].生态学报,2019,39(12):4337-4346.[29]寇智瑞,周鑫斌.不同连作年限黄壤烟田土壤细菌群落的差异[J].植物营养与肥料学报,2020,26(3):511-521.王磊,樊芳芳,白文斌,聂萌恩,江佰阳,王劲松,武爱莲,郭珺.不同连作年限高粱生长及根际土壤微生物群落功能多样性差异[J].山西农业科学,2020,48(09):1456-1460.基金:“科技助力经济2020”重点专项(SQ2020YFF0419231);山西省农业科学院重点项目(YGG1646);高粱遗传与种质创新山西省重点实验室项目(2019Q-2)。
