探讨促进兔腱-骨愈合方面脱细胞羊膜支架复合Scleraxis慢病毒转染的人羊膜间充质干细胞的效果.docx

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探讨促进兔腱-骨愈合方面脱细胞羊膜支架复合Scleraxis慢病毒转染的人羊膜间充质干细胞的效果文章快速阅读：文题释义：脱细胞羊膜支架：是一种通过对新鲜羊膜进行脱细胞处理后得到的天然支架，富含有丰富的细胞外基质成分，细胞能够在该支架表面正常生长。Scleraxis：是肌腱细胞/韧带细胞的特异性标志分子，在肌腱细胞和韧带细胞的发育和分化过程中发挥着重要的作用。韧带/肌腱损伤是临床上较为常见的疾病，多为意外性损伤[1]，损伤后常需要借助手术干预来重建韧带/肌腱。临床上常用的用于重建的移植物主要有股薄肌、半腱肌等[2]。虽然外科手术(重建损伤的韧带/肌腱)已成为治疗韧带/肌腱损伤的首要治疗方案，但由于腱-骨愈合的效果较差，其远期疗效很难满足患者的期望，尤其是运动员。韧带/肌腱与骨之间的特殊结构被称为腱-骨交界区，由一系列过渡的结构组成，包括韧带/肌腱、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨组织[3]。腱-骨交界区可以有效缓解从韧带/肌腱传递到骨的力[4]，但是交界区域的纤维软骨结构相对无血管性，因此损伤后愈合缓慢且难以完全恢复其原始结构[5]。由于腱-骨交界区具有特殊的结构和重要的功能，因此如何在损伤后加速其愈合已成为目前研究的热点。近年来，相关基础研究已经采取了多种方法来加速腱-骨愈合，主要包括基于细胞的疗法、使用生长因子以及使用各种仿生支架材料[6]，但是这些方法都很难形成可以在结构和功能上完全替代原来腱-骨交界面的特殊结构。尽管一些研究者观察到间接连接的形成[7,8]，但是在不同的腱-骨模型中形成的间接连接在组织结构和机械强度上远不如天然的腱-骨交界区。组织工程技术的出现和发展为临床疾病的治疗提供了新的思路和方向，其主要包括3大基本要素：种子细胞、生长因子和支架材料[9]。目前应用于组织工程技术的种子细胞主要来源于干细胞，包括骨髓间充质干细胞[10]、脂肪间充质干细胞[11]、绒毛膜来源间充质干细胞[12]、外周血来源间充质干细胞等[13]。骨髓间充质干细胞是使用最广泛的间充质干细胞，已被证实具有分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞的能力[14,15,16]，然而骨髓间充质干细胞的提取过程中存在一些潜在的风险，包括出血、免疫排斥和供体感染。近年来，人羊膜间充质干细胞由于其具有的独特优势，例如来源广泛、无创操作、无道德和伦理争议而广泛应用于基础研究[17,18]。Scleraxis作为韧带细胞/肌腱细胞的特异性标志分子，在肌腱细胞和韧带细胞的发育、分化过程中发挥着重要的作用，不仅对肌腱细胞/韧带细胞的发生、成熟起着重要的作用，还能够促进各种干细胞向肌腱/韧带分化[19,20,21,22]。由于单纯使用细胞因子存在费用昂贵、作用时间短等不足，因此通过病毒作为载体将目的分子导入靶细胞成为最近几年的研究热点[23,24,25,26]。慢病毒由于作用时间较长、对细胞的增殖影响较小，因此将其作为体内实验的首选基因操作工具[27]。该实验通过慢病毒转染的方式将Scleraxis基因导入人羊膜间充质干细胞并应用于动物体内，从而来促进动物腱-骨愈合。人羊膜是一种透明的薄膜，具有丰富的细胞外基质，包括透明质酸、纤连蛋白、胶原蛋白等[28,29,30]。脱细胞羊膜支架是由人羊膜通过脱细胞处理制成的天然生物支架，具有抗微生物、抗炎和非抗原性等优良特性，已被广泛用作构建组织和器官的工程支架[28,29,30]。因此，该实验探究脱细胞羊膜支架复合经Scleraxis慢病毒转染的人羊膜间充质干细胞是否具有促进兔腱-骨愈合的作用，旨在为临床治疗腱-骨愈合提供新的思路和方向。1、材料和方法1.1设计体外细胞实验，体内动物实验。1.2时间及地点实验于2019年1至9月在遵义医科大学免疫实验室完成。1.3材料实验使用的胎盘均来自于遵义医科大学附属医院产科足月健康产妇，无其他疾病，术前均签署知情同意书，符合遵义医科大学附属医院伦理委员会要求。实验用主要试剂和仪器：DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；青霉素/链霉素、三抗(青霉素-链霉素-两性霉素)(索莱宝公司)；谷氨酰胺(索莱宝公司)；非必需氨基酸(索莱宝公司)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)；CO2恒温箱(美国ThermoScientific公司)；超净工作台(北京冠鹏净化设备公司)；冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。实验动物：15只成年新西兰大白兔，体质量为3.0-4.0kg，雌雄不限，购买于陆军军医大学。1.4实验方法1.4.1人羊膜间充质干细胞的培养与传代在无菌条件下将羊膜从产妇胎盘上剥离并迅速转移到实验室，在超净台上用1×PBS冲洗数次，刮除多余的组织和血渍，然后用剪刀将羊膜剪成足够小的碎片，将碎片放在离心管中用0.05%EDTA-胰蛋白酶消化30min，连续2次，再用0.75g/LⅡ型胶原酶消化约1h，直到羊膜碎片基本消失为止，用滤网(300目)过滤收集滤液，离心，弃上清，然后用约1mLDMEM/F12培养基(含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸)重悬细胞，以适当的密度种植于75cm2培养瓶，隔天换1次培养基，观察细胞的形态和生长情况。当细胞生长到融合率为80%-90%时进行传代培养。每个75cm2培养瓶加入约3mL0.125%胰酶置于培养箱中消化2min，当大部分细胞变圆漂浮时加入等体积的终止液终止消化，然后离心弃上清，加入适量的培养基重悬细胞，计数后以1×109L-1细胞浓度接种于75cm2培养瓶中，传至第3代后将细胞种板，然后进行后续的相关实验。1.4.2Scleraxis慢病毒感染人羊膜间充质干细胞在课题组前期实验中已经成功摸索Scleraxis慢病毒的滴度并反复验证过[31]，该实验以最适感染复数(MOI=50)来感染人羊膜间充质干细胞。取第3代人羊膜间充质干细胞以(3.0-4.0)×105/孔接种于6孔板，24h后加入6.5μL慢病毒原液和1.2μL聚凝胺放入培养箱中继续培养，24h后将病毒吸出并且更换新鲜的培养基，48h后用3.5×103mg/L嘌呤霉素对感染慢病毒的人羊膜间充质干细胞进行筛选，从而获得稳定表达Scleraxis基因的人羊膜间充质干细胞，以便进行后续相关实验。1.4.3实时荧光定量PCR检测Scleraxis慢病毒感染人羊膜间充质干细胞后Scleraxis的mRNA表达水平将3组细胞(空白对照组、空载质粒组、Scleraxis慢病毒感染组)用PBS冲洗，然后用Trizol法提取细胞的RNA(冰上操作)并用紫外分光光度计测定RNA的含量。使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。选用GAPDH作为内参，目标基因相对表达量通过2-∆∆Ct法计算。1.4.4脱细胞羊膜支架的制备将刚取回的羊膜用PBS冲洗数次，去除表面的血渍，然后将其剪成适当大小放在玻璃皿中，用0.25%胰酶在37℃培养箱中消化30min。取出后用细胞刮匙将消化掉的上皮细胞从羊膜表面刮掉，然后再用PBS冲洗数次。用剪刀将羊膜剪成适当大小并且平铺在6孔板中，见图1；用三抗(青霉素-链霉素-两性霉素)将脱细胞处理后的羊膜支架进行浸泡消毒1h，然后用PBS冲洗数次，紫外线消毒1h，消毒完成后的脱细胞羊膜支架放在超净台自然晾干。1.4.5脱细胞羊膜支架性能检测将取回的新鲜羊膜和经过脱细胞处理后的羊膜分别用40g/L多聚甲醛固定24h，脱水，石蜡包埋并切片，苏木精-伊红染色观察脱细胞是否彻底，以及细胞外基质是否发生改变。脱细胞羊膜通过扫描电镜观察其孔隙率和空间结构是否适合细胞的黏附生长。1.4.6经Scleraxis慢病毒感染的人羊膜间充质干细胞在脱细胞羊膜支架上的生长情况将转染Scleraxis慢病毒的人羊膜间充质干细胞接种到脱细胞羊膜支架上面，然后放入培养箱中培养，每天观察细胞在支架上面的生长情况。通过鬼笔环肽染色进一步确定细胞是否在支架上存活并生长，以及形态是否发生改变。1.4.7体内动物实验15只新西兰大白兔分为3组，每组5只。所有新西兰大白兔给予3%戊巴比妥进行麻醉(0.75mL/kg)，然后备皮消毒，仰卧位固定在手术台上，沿右侧后肢切开皮肤，暴露跟腱，取长约2cm的跟腱作为移植物。在同侧膝关节正中切开皮肤，充分暴露胫骨上段并用2mm的钻头钻一直径为2mm的隧道，将取出的跟腱从骨隧道中穿出，两端缝合在周围的软组织上固定。空白对照组：跟腱未做特殊处理；脱细胞羊膜组：跟腱用脱细胞羊膜支架包裹，然后移植到骨隧道；脱细胞羊膜复合细胞组：跟腱用脱细胞羊膜支架包裹，支架上载有经Scleraxis慢病毒感染的人羊膜间充质干细胞。逐层缝合切口，术后3d使用青霉素预防感染。术后3个月空气栓塞将动物处死并取胫骨-移植物复合体进行相关检测。1.4.8动物标本切片染色标本取下后立即用40g/L多聚甲醛室温固定24h，然后用EDTA脱钙液脱钙约14d，待标本变软，用刀片可以轻轻划破时进行切片。首先将标本脱水处理，然后石蜡包埋后切片。切片成功后进行苏木精-伊红染色、番红-固绿染色，观察腱-骨愈合情况。1.5主要观察指标(1)人羊膜间充质干细胞在脱细胞羊膜支架上的生长情况；(2)脱细胞羊膜支架复合转染Scleraxis慢病毒的人羊膜间充质干细胞对腱-骨愈合的促进作用。1.6统计学分析采用SPSS18.0统计软件对数据进行分析。数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性意义。2、结果2.1人羊膜间充质干细胞的形态原代人羊膜间充质干细胞呈圆形或椭圆形生长，见图2A；经过传代培养后细胞逐渐呈现长梭形涡旋样贴壁生长，见图2B；第3代人羊膜间充质干细胞形态最为典型，细胞与细胞之间相互黏附，见图2C。2.2Scleraxis慢病毒感染人羊膜间充质干细胞以最适感染复数转染第3代人羊膜间充质干细胞，96h后在荧光显微镜下观察可见：Scleraxis慢病毒转染组和GFP空载质粒组可见明显的绿色荧光表达，空白对照组未见绿色荧光，见图3A-C。在普通显微镜下观察各组细胞形态均未见明显改变，说明慢病毒对细胞的生长影响较小。2.3实时荧光定量PCR检测Scleraxis慢病毒感染人羊膜间充质干细胞后Scleraxis的mRNA表达水平Scleraxis慢病毒转染组的ScleraxismRNA表达水平明显高于其他两组，差异有显著性意义(P<0.05)，而GFP空载质粒组和空白对照组的ScleraxismRNA表达水平未见明显差异(P>0.05)，见图4。2.4脱细胞羊膜支架的性能通过苏木精-伊红染色发现新鲜羊膜上皮层含有较为丰富的上皮细胞，基底层由大量的胶原纤维构成，见图5A；经过脱细胞处理后其上皮细胞被彻底清除，但是仍然保持完整的基底层，胶原成分仍然存在，且排列方式也未发生改变，见图5B；通过扫描电镜观察发现脱细胞羊膜支架具有均匀的孔隙率，胶原呈网状排列，见图5C。2.5经Scleraxis慢病毒感染的人羊膜间充质干细胞在脱细胞羊膜支架上的生长情况将Scleraxis慢病毒转染的第3代人羊膜间充质干细胞种植到脱细胞羊膜支架上并连续观察细胞在支架上的生长情况。第1天在普通倒置相差显微镜下观察可见有少量的细胞黏附在支架上生长，见图6A；连续培养后，细胞逐渐增多，在第7天时见大量细胞在支架上贴壁生长，见图6B。通过鬼笔环肽染色进一步确定细胞在支架上的生长情况，第1天有少量的细胞在支架上生长，见图6C；第7天可见密集的细胞分布在支架表面，且细胞形态较好，见图6D。2.6各组新西兰大白兔腱-骨愈合情况术后3个月苏木精-伊红染色发现空白对照组腱-骨交界面有大量的炎性细胞存在，并且腱-骨之间的间隙较大，说明腱-骨愈合情况较差；相比较而言，脱细胞羊膜组腱-骨交界面的间隙逐渐缩小，并且炎性细胞也逐渐减少；脱细胞羊膜复合细胞组腱-骨交界面之间几乎看不到明显的间隙，也很少有炎性细胞的存在，有大量排列规整的胶原纤维，说明其愈合较好。通过番红-固绿染色发现空白对照组腱-骨之间间隙较大，有大量的炎性细胞存在；脱细胞羊膜组虽然间隙逐渐缩窄，且炎性细胞逐渐减少，但是未能观察到纤维软骨的生成；脱细胞羊膜复合细胞组可见纤维软骨的生成，说明其愈合较好，见图7。3、讨论该实验体外成功分离了人羊膜间充质干细胞，原代人羊膜间充质干细胞呈圆形或椭圆形贴壁生长，随着不断的传代培养，细胞形态逐渐呈现长梭形、漩涡状生长，当细胞培养至第3代时，形态最为典型，可见明显的长梭形、涡旋状。然后体外成功构建了Scleraxis慢病毒，并将Scleraxis基因通过慢病毒转染至人羊膜间充质干细胞内，在96h可见明显的绿色荧光蛋白表达，证实病毒转染成功，通过实时荧光定量PCR检测结果显示：Scleraxis慢病毒转染组ScleraxismRNA的表达水平是空载质粒组和空白对照组的12倍，且空载质粒组和空白对照组ScleraxismRNA的表达水平未见明显差异，说明通过慢病毒的方式成功将Scleraxis导入到人羊膜间充质干细胞内，且对细胞的生长没有影响。该实验通过简单的方法制备了人脱细胞羊膜支架，用酶消化法对羊膜进行脱细胞处理。苏木精-伊红染色证实了脱细胞比较彻底，能够彻底将上皮层的上皮细胞去除，但是其他胶原成分未见明显改变，与正常的羊膜没有明显差异，扫描电镜观察发现该支架具有均匀的空隙率，适合细胞的生长，胶原成分呈网状分布。通过将人羊膜间充质干细胞种植到脱细胞羊膜支架上来验证其对细胞生长的影响，第1天可见少量的细胞在支架上生长，继续培养后细胞在支架上成倍的生长，细胞量逐渐增多。通过鬼笔环肽染色发现细胞在支架上生长状态良好，细胞形态未发生明显的改变。该实验在新西兰大白兔体内成功制备了关节外腱-骨愈合模型，即将自体肌腱移植到胫骨上段的骨隧道内，观察脱细胞羊膜支架负载转染后的人羊膜间充质干细胞对腱-骨愈合的作用。通过苏木精-伊红染色发现空白对照组腱-骨交界面有大量的炎性细胞存在，并且腱-骨之间的间隙较大，说明腱-骨愈合情况较差；相比较而言，脱细胞羊膜组腱-骨交界面的间隙逐渐缩小，并且炎性细胞也逐渐减少；脱细胞羊膜复合细胞腱-骨交界面之间几乎看不到明显的间隙，也很少有炎性细胞的存在，有大量排列规整的胶原纤维，说明其愈合较好。通过番红-固绿染色发现空白对照组腱-骨之间间隙较大，有大量的炎性细胞存在；脱细胞羊膜组虽然间隙逐渐缩窄，且炎性细胞逐渐减少，但是未能观察到纤维软骨的生成；脱细胞羊膜复合细胞可见纤维软骨的生成，说明其愈合较好。已经有相关研究证实了人脱细胞羊膜支架能促进软骨损伤的修复[32]，但是将脱细胞羊膜支架应用于腱-骨愈合的研究目前尚未见报道。正常腱-骨交界面由4层结构构成，其中最关键也是最难修复的就是纤维软骨部分。纤维软骨由于其缺乏血管，血供较差，因此损伤后很难修复，也是腱-骨愈合较差的主要原因。因此，将脱细胞羊膜支架用于腱-骨愈合具有一定的理论基础和临床价值。Scleraxis作为肌腱细胞和韧带细胞的特异性分子，具有促进细胞向韧带细胞和肌腱细胞定向分化的潜能，课题组前期实验研究也证实了Scleraxis能够促进人羊膜间充质干细胞向韧带细胞定向分化。该实验结果也证实了脱细胞羊膜支架复合转染Scleraxis慢病毒的人羊膜间充质干细胞具有促进兔腱-骨愈合的作用。Scleraxis作为韧带细胞/肌腱细胞的特异性标志分子，不仅对肌腱细胞/韧带细胞的发生、成熟起着重要的作用，还能够促进各种干细胞向肌腱细胞/韧带细胞分化[19,20,21,22]。由于单纯使用细胞因子存在费用昂贵、作用时间短等不足，因此通过病毒作为载体将目的分子导入靶细胞成为最近几年的研究热点[23,24,25,26]。慢病毒由于作用时间较长、对细胞的增殖影响较小，因此其作为体内实验的首选基因操作工具。该实验仍然存在以下几点不足：(1)该造模方法与临床上常见的腱-骨模型仍然存在着一定的差异。但是该实验的侧重点是观察腱-骨之间的愈合情况，并且该造模方法在其他研究中已经应用得比较多[33,34]，因此还是有一定的研究价值，但是后续还需要进一步改进造模方法，尽量与临床更接近；(2)该实验仅仅设置了一个时间点观察腱-骨愈合情况。腱-骨愈合其实是一个逐渐演变的过程，因此不同的时间点其愈合情况不同，所以后续需要设置更多的时间点来动态观察腱-骨愈合情况。图1脱细胞羊膜支架的制备过程图注：A：将羊膜从产妇胎盘上剥离；B：用胰酶消化新鲜羊膜，进行脱细胞处理；C：将脱细胞处理后的脱细胞羊膜支架放在培养皿中；D：将脱细胞羊膜支架平铺于6孔板图2倒置相差显微镜下观察人羊膜间充质干细胞的形态(×40)图注：图中A为原代人羊膜间充质干细胞，细胞呈圆形和椭圆形贴壁生长；B为第1代人羊膜间充质干细胞，呈长梭形、漩涡状生长；C为第3代人羊膜间充质干细胞，细胞与细胞之间相互黏附图4实时荧光定量PCR检测Scleraxis的mRNA表达水平图3Scleraxis慢病毒感染人羊膜间充质干细胞图注：图中A-C为Scleraxis慢病毒转染组、GFP空载质粒组、空白对照组荧光显微镜下观察的结果(×100)，各组细胞形态均未见明显改变，说明慢病毒对细胞的生长影响较小图5脱细胞羊膜支架的性能图注：图中A为新鲜羊膜上皮层含有较为丰富的上皮细胞，基底层由大量的胶原纤维构成(苏木精-伊红染色，×100);B为经过脱细胞处理后上皮细胞被彻底清除，但是仍然保持完整的基底层，胶原成分仍然存在，且排列方式也未发生改变(苏木精-伊红染色，×100);C为扫描电镜观察发现脱细胞羊膜支架具有均匀的孔隙率，胶原呈网状排列(×20000)图6Scleraxis慢病毒感染的人羊膜间充质干细胞在脱细胞羊膜支架上的生长情况(×100)图注：图中A,B为第1,7天细胞在支架上的生长情况，在第7天时可见大量细胞在支架上贴壁生长(倒置相差显微镜)；C,D为第1,7天细胞在支架上的生长情况(鬼笔环肽染色)图7各组新西兰大白兔腱-骨愈合情况(×100)图注：图中A-C为空白对照组、脱细胞羊膜组、脱细胞羊膜复合细胞组苏木精-伊红染色；D-F为空白对照组、脱细胞羊膜组、脱细胞羊膜复合细胞组番红-固绿染色参考文献：[31]朱喜忠,刘子铭,吴术红,等.Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞的定向分化[J].中国组织工程研究,2017,21(33):5382-5387.张骏,杨继滨,金瑛,邹刚,汤井沣,葛振,杨启帆,刘毅.脱细胞羊膜支架复合Scleraxis慢病毒转染的人羊膜间充质干细胞促进兔腱-骨愈合[J].中国组织工程研究,2020,24(13):2061-2067.基金:贵州省科学技术基金项目(黔科合LH[2017]7015号),项目负责人:邹刚.