探讨-淀粉酶酶活力测定方法的完善与应用前景.docx

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探讨β-淀粉酶酶活力测定方法的完善与应用前景β-淀粉酶，又称麦芽糖苷酶，是一种外切型糖化酶。可从淀粉非还原性末端开始依次切开间隔α-1，4-糖苷键，水解产物主要为麦芽糖和β-极限糊精[1-2]，发生沃尔登转化，产物构型由α-型转为β-型，故名β-淀粉酶[3]。由于大麦β-淀粉酶在种子萌发时无法合成而仅在籽粒中合成，因此未发芽籽粒中β-淀粉酶活性水平可作为评判其是否适用于啤酒酿造指标之一[4-5]。在啤酒酿造中，β-淀粉酶作为糖化剂具有重要作用[6]。生产过程中，β-淀粉酶酶制剂中通常存在其他酶类，特别是α-淀粉酶，如何在β-淀粉酶酶制剂中单独测定α-淀粉酶与β-淀粉酶酶活力受到关注[7]。目前测定β-淀粉酶酶活力方法主要有3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）、PNPβ-G3法等[8]。DNS试剂主要是通过测定酶解产物中还原糖含量确定β-淀粉酶活性，是最常用β-淀粉酶活力测定方法。由于植物中提取粗酶液和某些微生物表达β-淀粉酶中混有其他淀粉水解酶类（特别是α-淀粉酶）[9]，此情况下以还原糖含量表示酶活力值并不准确，DNS法测定粗酶液中β-淀粉酶酶活力存在问题[10]。由于DNS法灵敏度低、耗时，试剂具有毒性，较适用于纯化后β-淀粉酶动力学测定。目前常用β-淀粉酶酶活力测定方法为PNPβ-G3法，主要原理是以β-淀粉酶专一性底物对硝基苯酚麦芽戊糖苷为底物，通过测定β-淀粉酶与之反应释放对硝基苯酚量确定酶活力[10]，目前已有商业化试剂盒（爱尔兰Megazyme公司）。PNPβ-G3法是测定β-淀粉酶活力专一性方法，方法快速、灵敏、操作简便，但其酶活力以单位时间内释放对硝基苯酚麦芽戊糖苷量计量，对评估β-淀粉酶在淀粉糖化过程中酶活力无直接借鉴意义，一般用于测定重组表达β-淀粉酶酶学性质，具有局限性[11]。因此，需要一种更简便、准确方法测定粗提取大麦淀粉酶中β-淀粉酶绝对酶活力。酶活测定方法改良研究中，邹国林将超氧化物歧化酶测活曲线通过数学方法变为线性关系，减少工作量[12]。李永仙采用改良AZO方法测定葡聚糖酶酶活，不需使用昂贵葡聚糖试剂作为底物即得到准确酶活力值[13]。凌腾芳等采用β-淀粉酶专一性底物建立微量、快速测定植物β-淀粉酶酶活性方法[14]，但人工合成底物不具直接借鉴意义。本研究在凌腾芳等基础上将DNS测定方法与PNPβ-G3法结合，使用两种方法测定相同浓度β-淀粉酶酶活力值，对测定结果作线性拟合，得到线性拟合方程。根据PNPβ-G3法测定结果直接换算成β-淀粉酶水解淀粉生产麦芽糖能力，获得一种准确、简便测定粗酶液中β-淀粉酶绝对活力值方法。1、材料与方法1.1材料Beta-AmylaseAssayProcedure（Betamyl-3Method）试剂盒购自爱尔兰Megazyme公司；β-淀粉酶酶制剂（BR级别）购自北京生东科技公司；麦芽糖、可溶性淀粉、磷酸氢二钠、柠檬酸、氢氧化钠、乙酸钠、亚硫酸钠、酒石酸钾钠、氯化钠等均为分析纯，购自国药集团。试验所用试剂包括磷酸盐缓冲液（20mmol·L-1，pH6.0）、麦芽糖标准溶液（1mg·mL-1）、1%淀粉溶液、牛血清蛋白（BSA）标准溶液、终止缓冲液（1%Tris-base，pH8.5）以及DNS试剂。含大麦β-淀粉酶基因重组大肠杆菌菌株为本课题组前期构建[15]，保藏于江南大学酿酒科学与工程研究室。1.2主要仪器XMTD-204数显式电热恒温水浴锅，上海博讯医疗设备厂；UV1102可见光分光光度计，上海天美科学仪器公司；PowerpacBasic蛋白电泳仪，美国Bio-rad公司；Enspire多标记检测系统（酶标仪），珀金埃尔默有限公司。1.3方法1.3.1重组大麦β-淀粉酶获得江南大学酿酒科学与工程研究室存有一株可表达大麦β-淀粉酶基因重组大肠杆菌，参考文献[15]培养条件诱导重组蛋白表达，冰浴条件下利用超声细胞破碎仪破碎细胞，离心收集上清液作为粗蛋白样品，采用Ni-NTA亲和层析柱对蛋白质作亲和层析纯化，50mmol·L-1咪唑洗脱杂蛋白，100mmol·L-1咪唑洗脱目的蛋白，收集洗脱目的蛋白以SDS-PAGE作纯度验证，4℃保存。1.3.2大麦淀粉酶粗提取研磨一定量麦芽，使用0.5mm筛子收集研磨粉，准确称取5g研磨粉，加入50mL提取缓冲液（1mol·L-1Tris-HCl，20mmol·L-1EDTA二钠，0.02%叠氮化钠，pH8.0），室温下，将混合液在漩涡混合器上剧烈搅拌超过1h（1h内约5次）后离心收集上清液，并转入30ku超滤离心管，经浓缩离心后收集超滤管内液体作为粗酶液[16]。1.3.3Bradford法测定蛋白浓度取7支离心管，分别添加0、10、20、30、40、50、60、70μL牛血清蛋白（200μg·mL-1）标准溶液，用去离子水补充离心管中体系为200μL，各管中加入2mLBradford试剂，使用分光光度计测量其在595nm处吸光度值，绘制标准曲线，得线性回归方程为y=0.0019x+0.0004（R2=0.9972）[17]。1.3.4DNS法测定β-淀粉酶酶活力酶活力定义为：1mL酶液在55℃、pH6.0条件下，10min水解1％（W/V）可溶性淀粉液生成1mg麦芽糖，即为1个酶活力单位，以U·mL-1表示。标准曲线绘制：取若干支10mL具塞比色管，分别加入0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL麦芽糖标准溶液（1mg·mL-1），然后向管中加入蒸馏水2mL，再加入3mLDNS试剂，沸水浴加热10min，取出冷却至室温，取2mL反应液加蒸馏水稀释至10mL。混匀后以未加麦芽糖标准溶液比色管为对照在540nm下测量吸光度，以吸光度为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标，绘制标准曲线，得出线性回归方程为y=2979+0.0226（R2=0.9935）。样品测定：取若干10mL具塞比色管编号，分别加入1mL酶液（20mmol·L-1磷酸盐缓冲液稀释）和1mL1%淀粉溶液，55℃恒温水浴反应10min，置于冰水浴2min终止反应，然后加入3mLDNS试剂，混匀，沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温，取2mL反应液用蒸馏水定容至10mL，以蒸馏水代替酶液为空白，540nm处测定吸光度，计算酶活力。酶活力计算公示：β-淀粉酶活力（U·mL-1）=E×n×5h式中，E-样品溶液吸光度；n-样品溶液稀释倍数；5-2mL反应液换算成10mL倍数；h-标准曲线斜率。1.3.5PNPβ-G3法测定β-淀粉酶酶活力[11]使用爱尔兰Megazyme公司Betamyl-3Method试剂盒测定酶活力，方法参考试剂盒说明书略作修改。分别取20μL酶液于2mLEP管，并与专一性底物对硝基苯酚麦芽戊糖溶液共同置于55℃下保温2min，55℃下反应10min，加入300μL终止缓冲液，取200μL反应液，以蒸馏水为对照测定400nm处吸光度。2、结果与分析2.1重组大肠杆菌来源β-淀粉酶提取与纯化测定所用β-淀粉酶必须为不含其他任何淀粉水解酶类纯化β-淀粉酶。将本研究室前期保藏重组大肠杆菌经过诱导表达、菌体收集后，通过超声波破碎法破壁提取β-淀粉酶，离心浓缩后通过HiTrapQHP阴离子交换柱纯化蛋白质。纯化结果如图1所示，纯化后β-淀粉酶在SDS-PAGE图谱中为单一条带，说明β-淀粉酶已达到电泳纯，可用于进一步分析，通过Bradford法测得β-淀粉酶酶液蛋白浓度为240μg·mL-1。图1大肠杆菌诱导表达β-淀粉酶纯化SDS-PAGE结果2.2线性浓度范围确定对两种测定方法结果作线性拟合前，先需确定每种方法测定结果与酶活成线性关系β-淀粉酶溶液浓度范围[12,18]。首先将β-淀粉酶溶液用磷酸盐缓冲液稀释至12~96μg·mL-1，采用DNS法和PNPβ-G3法分别测定酶促反应结束后溶液对应波长下吸光值，并分析β-淀粉酶浓度与吸光值结果相关性。如图2A所示，PNPβ-G3法在β-淀粉酶浓度12~96μg·mL-1范围内线性较好，其R2为0.9959。DNS方法在β-淀粉酶浓度12~96μg·mL-1时R2为0.9693，而当β-淀粉酶浓度为12~60μg·mL-1时R2达0.9887（见图2B和2C）。说明PNPβ-G3法在较宽酶浓度范围内测得β-淀粉酶酶活力与吸光度值拟合度较好，当β-淀粉酶浓度较高时，DNS方法测定结果偏离线性关系，如图2B所示。综合两种方法测定β-淀粉酶浓度范围与线性关系，作线性拟合测定时β-淀粉酶浓度范围为12~60μg·mL-1。2.3方法精密度试验配制6份12~60μg·mL-1范围内β-淀粉酶溶液样品，每个浓度样品配10份，分别采用DNS法和PNPβ-G3法测定样品反应结束后酶活力值及溶液对应吸光度值5次，结果见表1。PNPβ-G3法和DNS法测定5份平行样品之间吸光度值波动范围较小，相对偏差分别为1.6%~8.8%和3.3%~7.3%，均<10%，表明测活实验具有良好重复性。图2线性浓度范围；表1DNS法与对PNPβ-G3法精密度试验（n=5）2.4线性拟合法应用与验证在2.3试验基础上，将DNS法测得平均β-淀粉酶酶活力值与PNPβ-G3法测得平均吸光度值作线性拟合，结果如图3所示，其R2为0.9886，线性回归方程为y=0.0079x+0.0089。说明两种方法具有良好线性拟合程度，可将PNPβ-G3法测得OD400值直接通过线性拟合公式换算成β-淀粉酶绝对酶活力值，由于PNPβ-G3法测得吸光度值与DNS测得β-淀粉酶酶活力具有良好线性关系，因此通过该方法还可判断β-淀粉酶样品纯度，确定其是否含有其他淀粉水解酶。为验证上述假设准确性，以购自北京生东科技公司商业β-淀粉酶及粗提取大麦β-淀粉酶为样品进一步测定。首先将两种β-淀粉酶酶液稀释至表2中浓度，分别采用DNS法和PNPβ-G3法测定其酶活力，将PNPβ-G3法测得吸光度值通过上述线性拟合曲线换算为酶活力值，并与DNS法测得酶活力值比较。结果如表2所示，采用DNS法测定商品β-淀粉酶酶活力值和PNPβ-G3法测定得到换算值比较接近，相对偏差均小于10%，由此推断商品β-淀粉酶纯度较高且不含α-淀粉酶。粗提取大麦β-淀粉酶酶活值换算结果远低于DNS方法测定结果，相对偏差达30%左右，由此推断其粗酶液中不仅含β-淀粉酶，还存在少量α-淀粉酶。为进一步验证推断结果，对商品β-淀粉酶与大麦中粗提β-淀粉酶作SDS-PAGE电泳检测，结果显示大麦β-淀粉酶在50与59ku出现2条条带，而商业β-淀粉酶仅出现一条条带（见图4）。说明该方法可有效判断β-淀粉酶样品中是否含α-淀粉酶。图3线性拟合曲线；表2线性拟合法应用；图4大麦β-淀粉酶与商业β-淀粉酶SDS-PAGE结果2.5线性拟合方法应用前景在啤酒行业中，通过测定大麦未发芽籽粒中β-淀粉酶酶活性水平，可判断该籽粒是否适用于啤酒酿造，DNS法不能准确获得β-淀粉酶酶活水平，PNPβ-G3法测定结果无可比性，本研究改进方法可准确有效测定大麦种子中β-淀粉酶酶活力。在淀粉加工行业中，常从大麦中提取β-淀粉酶。在用于高麦芽糖浆生产时，需较高纯度β-淀粉酶，尤其不能有α-淀粉酶干扰。采用本研究改进方法可快速判断β-淀粉酶纯度，检测其是否含有其他淀粉水解酶类，保证生产高麦芽糖浆时所用β-淀粉酶纯度，相较于蛋白电泳检测方法更加简便、安全。在测定重组β-淀粉酶酶活力时，有些微生物分泌α-淀粉酶，故DNS法测定结果存在一定问题，此时应用线性拟合方法可得到β-淀粉酶准确酶活力值。3结论本研究结合两种常用β-淀粉酶活力测定方法，通过PNPβ-G3法测定β-淀粉酶活力结果，可准确换算成β-淀粉酶水解淀粉产生麦芽糖能力，解决DNS测定方法耗时、受α-淀粉酶干扰缺点。无论是测定纯化β-淀粉酶样品还是β-淀粉酶酶制剂混合物，均可准确测得β-淀粉酶绝对酶活力值。本研究改进β-淀粉酶测活方法在排除α-淀粉酶干扰同时，还可以准确测定β-淀粉酶以淀粉为底物时酶活力，通过对比PNPβ-G3法测得换算结果与DNS方法测定结果，可探讨酶液样品中是否含有β-淀粉酶以外其他淀粉水解酶类。若两者结果相似，可认为酶液样品中不含其他淀粉酶，若换算结果低于DNS方法测定结果，则酶液样品中存在其他淀粉水解酶干扰。本研究改进方法线性范围广，重复性好，可准确有效专门测定β-淀粉酶酶活力，判断样品中β-淀粉酶纯度，适合工业应用与学术研究。参考文献：[1]于轩.不同来源淀粉的分子结构对其酶解性能影响的研究[D].无锡:江南大学,2013.[2]王海明.β-淀粉酶与高辅料啤酒酿造[J].啤酒科技,2000(6):6-9.[3]齐继艳,陈舟舟,卢晗,等.植物β-淀粉酶[J].植物生理学报,2008,44(2):334-340.[4]张萧萧,牛丹丹,沈微,等.β-淀粉酶的表达与酶学性质[J].食品科学,2016,37(3):164-169.[5]张剑,林庭龙,秦瑛,等.β-淀粉酶研究进展[J].中国酿造,2009,28(4):5-8.[6]姜晓东,张京,郭刚刚.中国大麦地方品种的α-淀粉酶酶活性研究[J].植物遗传资源学报,2013,14(2):322-328.[7]邹国林.超氧化物歧化酶活力测定曲线的线性化研究[J].武汉大学学报:理学版,1996(6):779-782.[8]李永仙.产β-葡聚糖酶的重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl的诱导表达及发酵[D].无锡:江南大学,2009.汪薛良,钮成拓,包敏,李崎,王金晶.β-淀粉酶酶活力测定方法改进及应用[J].东北农业大学学报,2019,50(2):56-61.