颞下颌关节骨关节病关节患者关节液的定量蛋白质组学研究.docx

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颞下颌关节骨关节病关节患者关节液的定量蛋白质组学研究颞下颌关节骨关节病（temporomandibularjointosteoarthropathy,TMJOA）是发生在关节软骨和关节下骨的非炎症性退行性疾病，以进行性关节软骨丧失为主，伴有软骨修复和软骨下骨重塑或硬化为主要病理表现[1]。青少年及以上年龄段人群均可发病，发病率随年龄增大而升高[2]。主要临床表现为关节区捻发音或破碎音，可有开口受限或下颌运动障碍，当出现关节区疼痛症状时，定义为颞下颌关节骨关节炎[3]。另外可伴随着头痛、耳部症状、颈部症状以及全身症状，严重影响患者的生活质量。目前其病因不明，临床诊断主要依靠病史、临床表现及影像学检查，缺乏实验室诊断方法[4]。蛋白质组学可阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，已广泛用于肿瘤、心血管、神经系统等疾病状态下的特异表达蛋白的鉴定，疾病标志物筛选、发病机制研究、新药开发等[5]。因此，蛋白质组学可能为TMJOA的诊断及病因探讨带来新突破。2004年美国应用生物系统公司（ABI）开发的多肽体外同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）可同时对多达8种样品进行绝对和相对定量研究[6]。其对低丰度蛋白检测的灵敏度高，分离能力强，可定性定量同步进行，与质谱技术联用，可高效筛选出差异表达蛋白。目前，基于该技术的蛋白质组学已经在膝关节等大关节疾病的标志物筛选和机制探讨研究中广泛开展[7,8]。为此，本研究通过iTRAQ技术对颞下颌关节液进行检测，旨在探索该病患者关节液中的差异表达蛋白，并结合生物信息学技术分析，筛选出该疾病的潜在生物学标志物，并从分子学水平探讨其可能发病机制。1、资料与方法1.1一般资料于2019年5～10月选择重庆医科大学附属口腔医院22例行颞下颌关节玻璃酸钠注射治疗的TMJOA患者作为实验组，其中男2例，女20例，均符合SchiffmanE等[9]的诊断标准。另外收集同期10名健康志愿者作为健康对照组，其中男1名，女9名。本研究经本单位人体试验伦理委员会的审查批准[2019年伦审（63）号]并符合2013版赫尔辛基宣言，已取得患者及其家属的知情同意并签署知情同意书。1.2纳入及排除标准纳入标准：(1)可有关节弹响史及间断性关节绞索史；(2)关节捻发音；(3)可有开口型异常或开口受限；(4)关节区无明显疼痛；(5)CBCT显示存在关节病变：髁突骨皮质模糊或不连续，骨质小凹陷缺损和破坏，包括松质骨在内的硬化性骨质增生、囊样变、骨质破损或磨短扁平，骨赘形成。排除标准：(1)MJ外伤史、感染史、肿瘤等颞下颌关节疾患者；(2)患有甲状腺和甲状旁腺功能亢进、肝肾疾病、糖尿病等影响骨代谢疾病；(3)近1年接受过颞下颌关节腔内注射药物及其他治疗者；(4)有严重的系统性疾病者；(5)孕妇及哺乳期妇女；(6)有中、重张口受限者；(7)有明显的精神或心理问题者；(8)资料不全者。1.3方法1.3.1标本采集受试者取半仰卧位于45°牙科治疗椅上，常规皮肤消毒铺巾，嘱其大张口，穿刺点为耳屏中点至外眦连线上、耳屏前1cm处，用5号注射器向前上内刺入颞下颌关节间隙水平面，抵关节结节后斜面，刺入关节腔，回抽无血后注射2%利多卡因1.5ml，反复灌洗5次后抽尽液体，再注入透明质酸钠（施沛特）1ml。注射完毕后，嘱患者紧密咬合，用消毒纱布压迫针刺点2～3min，避免局部出血。健康志愿者无注射透明质酸钠步骤。采集的关节液低温保存下尽快送往实验室，离心（4℃，2000r/min,10min），分装到EP管，-80℃保存。1.3.2蛋白质定量Bradford法测定蛋白浓度，根据标准曲线和蛋白样品稀释倍数计算出蛋白样品的浓度。1.3.3iTRAQ联合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）鉴定取两组适量样品进行蛋白质提取。用100mmol/LTEAB将蛋白溶液稀释5倍，按1:50的质量比例（胰酶：蛋白）加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜。酶解后的肽段用C18柱脱盐。iTRAQ-8标试剂盒（SCIEX）对各肽段进行标记（N:114,OA:115），并均匀混合。将混合后的肽段运用Ultimate3000HPLC系统（ThermoDINOEX,USA）对肽段样品进行分级分离。色谱柱使用的是DurashellC18柱（5μm,100A。，4.6×250mm)。利用碱性条件下逐渐升高的ACN浓度实现肽段的分离，流速为1ml/min，每分钟收集1管。将标记后的多肽样品加到C18捕获柱（5μm,100μm×20mm）上，并以90min时间梯度，300nl/min的流速在C18分析柱（3μm,75μm×150mm）上用缓冲液A(2%乙腈/0.1%甲酸/98%H2O）和缓冲液B(98%乙腈/0.1%甲酸/2%H2O）进行梯度洗脱。使用TripleTOF5600plus质谱仪检测肽段信号，以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以50ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图。在350～1500m/z的范围内采集MS1光谱，并在100～1500m/z的范围内采集MS2光谱。将前体离子动态排除时间设置为15s。1.3.4数据分析对于鉴定到的肽段，设置可信度水平在95%以上。仅保留至少包含一个唯一肽段且可信的肽段进行蛋白质定量。当差异倍数≥1.5或≤0.67，且经过显著性统计检验其P值≤0.05时，认为该蛋白存在表达差异。应用DAVID富集分析平台对初步鉴定的差异表达蛋白功能富集分析，选择G0分析生物过程、细胞组分和分子功能注释对差异蛋白分类，选择KEGG通路数据库对差异蛋白所涉及的代谢通路进行分析。通过STRING数据库以及Cytoscape3.6.1软件进行蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络分析。1.4统计学方法差异蛋白的P值计算采用Proteinpilot软件内置算法获得的，由与蛋白质匹配的所有谱图的差异倍数经过单样本Student’st检验获得的。最后根据差异倍数和Pvalue来筛选显著差异蛋白。当差异倍数达到1.5倍及以上（即up＿regulate≥1.5和down＿regulate≤0.67），且经过显著性统计检验其P≤0.05时，视为显著差异蛋白。2、结果2.1总蛋白质定量信息从定量信息结果来看，关节液样本蛋白总量满足上机标准，两组蛋白浓度见表1。2.2两组差异表达蛋白共鉴定出370种蛋白，共鉴定出蛋白370个，与健康对照组相比，实验组中差异表达蛋白82个，其中上调蛋白35个，下调蛋白47个（差异倍数≥1.5或≤0.67,P≤0.05），差异蛋白的火山图见图1。其中排名上、下调前10的差异蛋白见表2。表1蛋白定量结果表2上、下调排名前10的差异表达蛋白图1两组差异蛋白分布火山图2.3生物信息学分析GO注释结果显示，差异蛋白主要参与的生物学过程包括cellularprocess,metabolicprocess,biologicalregulation,responsetostimulus等。主要涉及的分子功能包括binding,catalyticactivity,enzymeregulatoractivity等，且这些差异蛋白大多数属于extracellularregionpart成分。见图2。KEGG信号富集分析显示，前20条通路中PPARsignalingpathway通路的富集程度最高，而complementandcoagulationcascades通路中包含差异表达蛋白数量最多（13个），其次为systemiclupuserythematosus通路（10个），见图3。3、讨论在骨关节疾病中，滑膜细胞分泌的关节液（SF）与关节直接接触，起到润滑和营养关节的作用，也与疾病的状态密切相关[10]。关节液中含有部分从软骨关节中释放的蛋白质，能直接地反映病变的病理生理特征[11]。且对于关节液的采集技术已经非常成熟，属于微创技术[12]。目前，国内外尚无采用人体颞下颌关节液标本进行蛋白质组学分析的研究，因此本研究通过直接检测颞下颌关节液内蛋白质组的变化情况，更精确反映关节内环境随疾病发生发展的变化，以寻找与疾病密切相关的生物标志物及发病机制。iTRAQ-LC-MS/MS技术成功筛选到多个与TMJOA可能有密切盥洗的差异表达蛋白，整合分析差异倍数、生物信息学分析结果，同时查阅相关文献，我们对其中部分差异表达蛋白进行初步探讨。补体4结合蛋白α链（C4BPA），是一种可溶性血清糖蛋白抑制剂，可通过经典途径抑制补体活化通路。它作为辅助因子，可抑制C3转化酶（C4bC2a）的形成并促进Ⅰ因子对C4b的裂解[13]。它也与抗凝蛋白S和血清淀粉样蛋白相互作用，可延长C4bp的半衰期，从而强化C4bp的抑制作用[14]。VicentiG等[15]对OA患者的关节滑液检测研究中，发现C1、C2、C3、C4、C5、C4BPA等在疾病组表达的升高。WatanabeA等[16]报道，在关节过度活动综合征（JHS）患者的血清中检测到C1R、C9、C4BPA、VTN等蛋白表达上调。在类风湿关节炎中同样可检测到C4BPA增加，它由炎症的滑膜组织表达，与滑膜炎的严重程度密切相关[17]。C4BPA在TMJOA的关节液中表达上调，定位到补体和凝血级联反应通路，可能通过该途径调节补体系统的激活状态，从而影响TMJOA的发生与发展。同时，在该途径中检测到经典补体通路中CFAD、C1r、C1s等成分的差异表达，说明了TMJOA的发病机制与补体途径有重要关系，但是具体调控机制有待进一步验证研究。图2差异蛋白的GO注释结果图3差异表达蛋白的富集通路CD5L是一种凋亡抑制剂，主要由淋巴组织和炎症组织中的巨噬细胞表达，是控制免疫稳态和炎症过程的关键蛋白[18]。它与CD5相似，属于SRCR超家族。主要位于细胞外区域或作为可溶性分泌蛋白，也是脂质合成的关键调节剂。目前，仅有一篇文献报道了CD5L与骨关节炎的关系，BalakrishnanL等[19]发现膝关节关节液中的CD5L的含量是RA患者中的3.3倍。在本研究中，其表达在TMJOA中较正常组显著增高（O/N:9.6倍），可作为疾病的诊断标志物。CD5L的GO功能富集到清道夫受体活性，一方面，可以通过激活TLR而促进抗炎因子的表达，同时CD5L介导的自噬可诱导转录因子ID3，从而驱动巨噬细胞吞噬作用极化[20]。对于CD5L在TMJOA中的作用机制，需要后续细胞水平以及基因组，转录组等多方面验证。显著下调蛋白PRDX2,PRDX6均为硫醇特异性过氧化物酶，在细胞对抗氧化应激的保护中发挥作用。在一项以大鼠股骨关节IL-1α所致的OA模型中，检测出了软骨组织中PRDX2表达下调[21]。研究表明，软骨细胞凋亡在OA发病机制中有总要作用，而PRDX2家族对于对软骨细胞的氧化应激损伤具有保护作用[22]。PRDX6还主要参与脂质降解过程，在肥胖相关代谢性疾病（例如肝脏疾病和Ⅱ型糖尿病）的发展中可能具有功能和保护作用[23]。本研究中该类蛋白显著下调（O/N:PRDX20.026倍；PRDX60.08倍），GO富集到了脂质分解代谢过程（lipidcatabolicprocess）、对活性氧的反应（responsetoreactiveoxygenspecies）和氧化应激反应（responsetooxidativestress）的生物学过程，pathway富集到了代谢通路（metabolicpathways），因此可以推测PRDX通过调节氧化应激和脂质代谢，从而在TMJOA的关节软骨细胞完整性中起着重要作用。碳酸酐酶（CAH）是锌金属酶，其两种同工酶CAH1(O/N:0.029倍）和CAH2(O/N:0.034倍）在TMJOA中显著下调。CAH1和CAH2位于细胞质内，与HCO3-转运有关，参与H++HCO3-=CO2+H2O反应过程，可调节pH。关节液的低pH，可能与RA、OA的炎症及疼痛机制有关[24]。在TMJOA的SF中，CAH1、CAH2表达下调，因此HCO3-不能及时转运以消耗SF中大量的H+，从而造成酸性环境，同时降低关节修复，导致TMJOA的病理发展。通路富集分析结果显示，DEPs主要富集在凝血补体通路（complementandcoagulationcascades）和过氧化物酶体增殖物激活受体通路（PPARsignalingpathway）。已有研究表明，凝血补体通路在膝关节骨OA的发病机制中具有重要作用，因此，可通过相关补体成分（C1r、C1s、C4BPA）以及相关凝血成分（FIBB,FIBG,KAIN）等通过该通路影响TMJOA的发生和发展[25]。在OA与RA的基因表达分析研究中，发现PPAR信号通路的激活是这两种疾病的共同致病通路，同样在OA与正常关节滑膜的差异基因通路分析中也富集到了该通路[26]。过氧化物酶体增殖物激活受体通路在TMJOA的病理生理过程中可能扮演着重要角色，这对TMJOA的治疗提供了新的研究方向。本研究由于病例纳入困难，属于小样本实验。对于选取的患者平均年龄，TMJOA多见于中老年人，和志愿者平均年龄差距较大，不能排除样本量和年龄的影响。今后需要更多大样本实验，将不同年龄段以及性别进行分组检测，以降低偏倚，提高数据结果的准确性。综上所述，本实验通过蛋白质组学技术建立了TMJOA和正常关节滑液的差异表达蛋白谱，这些蛋白质分子可以作为TMJOA诊断及疾病进展监测的生物标志物，且揭示TMJOA的发病机制可能与免疫、炎症、氧化应激、脂质代谢等有关，为研究TMJOA的进展和临床诊治及预后提供理论依据。C4BPA、CD5L、PRX2、CAH1等可作为TMJOA候选生物标志物及药物治疗靶点。Complementandcoagulationcascades,PPARsignalpathway通路在TMJOA的发生过程中有重要。胡静,钟晓波,朱士胜,冯驰,李汶洋.颞下颌关节骨关节病关节液的定量蛋白质组学研究[J].医学信息,2020,33(10):65-69+89.基金:国家自然科学基金(编号:81600832);2016年重庆高校创新团队建设计划资助项目(编号:CXTDG201602006)。