绿薄荷茎叶乙醇提取物对小菜蛾幼虫的作用机制探究小菜蛾（PlutellaxylostellaL.）属鳞翅目菜蛾科，是十字花科作物重要的世界性害虫[1,2]。其具有繁殖力高、适应性强和生活周期短等特点，经常造成毁灭性为害，尽管多种杀虫剂已被用来控制这种有害生物[3,4]，但小菜蛾对大多数杀虫剂都表现出较高的交叉耐药性和多重耐药性，防治效果并不理想[5]。有研究表明，小菜蛾对氯虫腈、氟苯二酰胺以及相对较新的杀虫剂二酰胺有抗药性[6,7,8]。而植物源农药由于安全性高、不污染环境和对农产品无残留等优点，可替代化学农药的使用。绿薄荷（MenthaspicataL.），通常被称为留兰香，是一种常见的多年生草本植物。全株具有浓烈的清凉香味，常用于凉茶、烹饪以及传统药物中[9]。此外，据报道，薄荷具有杀虫、抗菌、解痉、抗氧化和抗真菌活性等作用[10,11,12]。近年来，植物提取物与昆虫行为之间的化学生态学成为了研究热点[13,14]。多种植物提取物对昆虫有引诱、趋避、毒杀和拒食作用[15,16]。有研究显示，薄荷属植物，如小叶薄荷、留兰香和欧薄荷具有杀病虫活性，表明薄荷已逐渐应用于病虫害防治[17]。薄荷精油对温室白粉虱（Trialeurodesvaporariorum）的触杀作用很强[18]；对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑菌活性[19]；对双斑长跗萤叶甲的驱避率高达74.00%±5.47%[20]。薄荷还能抑制朱砂叶螨（Tetranychuscinnabarinus）体内酶的活性，最终致其死亡[21,21]。根据报道[21,21]，绿薄荷的乙醇提取物对小菜蛾幼虫的拒食和成虫的产卵忌避均有显著作用。但是，目前关于绿薄荷提取物对小菜蛾幼虫的作用机制尚不明确。已知许多植物精油和植物提取物会抑制昆虫体内的解毒酶活性，目前主要是通过测定虫体内酶系活性的变化来分析其对害虫的作用机制[21,21]。有研究表明，植物次生代谢物对昆虫有毒害作用时，虫体通过调节解毒酶系的活性，起到解毒和排毒的作用，进而防止或减少逆境胁迫对其造成的危害[22,23,24,25,26]。其中，乙酰胆碱酯酶（AchE）、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST-s）最具代表性[27,28]。朱香镇等[29]研究了2种植物源次生物质对绿盲蝽（Apolyguslucorum）不同龄期幼虫的谷胱甘肽-S-转移酶（GST-s）的活性影响，结果表明，绿盲蝽受到不同种类外源次生物质或者不同浓度同种外源次生物质胁迫后，体内解毒酶活性的变化是一个复杂的过程。王瑞龙等[30,31]研究结果表明，斜纹夜蛾（Spodopteralitura）幼虫取食含有6种植物次生物质的饲料，均提高了GST的活性，说明植物次生物质可诱导斜纹夜蛾体内解毒酶活力，以提高它抵抗有毒物质的能力。据报道，牛至（OriganumvulgareL.）和藜属植物（ChenopodiumalbumL.）的精油对AchE具有抑制作用。本试验用不同浓度的绿薄荷茎叶提取物喂食小菜蛾3龄幼虫，测定其体内主要解毒酶的活力，进而判断绿薄荷茎叶提取物对小菜蛾的作用机制。1、材料和方法1.1材料1.1.1供试植物绿薄荷（MenthaspicataL.）种植于山西农业大学农作站，分离茎和叶以制备提取液。甘蓝（BrassicaoleraceaL.）种植于山西农业大学温室，品种是五月慢，供试验所用。1.1.2供试虫源试验所用小菜蛾3龄幼虫由山西农业大学农学院昆虫神经行为与感觉生物学实验室提供，饲养温度为（25.0±1.0）℃，相对湿度为70%±5%。1.1.3主要试剂Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、无水碳酸钠、无水乙醇和丙酮均购于天津市天力化学试剂有限公司；碘化硫代乙酰胆碱（ATChⅠ）、二硫双对硝基苯甲酸（DTNB）、乙酸-1-萘酯（α-NA）和1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）均购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司（TCL）；毒扁豆碱购于Fluka；固蓝RR盐购于上海恒远生物科技有限公司；还原型谷胱甘肽（GSH）购于上海生物工程公司；牛血清蛋白（BSA）购于上海励瑞生物科技有限公司。1.2方法1.2.1酶液的制备使用陈立等[32]的浸叶法，将甘蓝叶片分别使用质量浓度为12.5、25.0、50.0、100.0mg/mL的绿薄荷茎叶乙醇提取物浸泡后喂养小菜蛾3龄幼虫，12、24、36、48h后取10只活虫制备酶液，置于0.5mL0.5mol/L的磷酸缓冲液（pH=7）中匀浆，15000r/min离心15min，取上清液，作酶原，重复6次。以95%乙醇处理的甘蓝叶片喂食幼虫，作为对照。根据考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度，计算酶活性[32,33]。1.2.2小菜蛾幼虫体内AchE活性测定AchE活力测定参考慕立义[34]的方法，稍作改进。在试管中分别加入10μLATChⅠ、10μLDTNB、160μL0.1mol/LPBS和20μL酶液，对照为蒸馏水。使用酶标仪测定并记录在波长412nm时3min内吸光度值的变化[32]，计算AchE活性。1.2.3小菜蛾幼虫体内CarE活性测定参照慕立义[34]的方法，经改进后测定CarE活性。在试管中分别加入10μL毒扁豆碱、160μLα-NA+固蓝RR盐和10μL酶液，对照为蒸馏水。使用酶标仪测定并记录在波长450nm时3min内吸光度值的变化，计算CarE活性。1.2.4小菜蛾幼虫体内GST-s活性测定使用改进后慕立义[34]的方法，测定GST-s活性。在试管中分别加入180μL磷酸缓冲液、20μL酶液、10μLGSH和10μLCDNB使反应开始，通过测定340nm时5min内吸光度值的变化，计算GST-s活性。1.3数据分析使用SPSS17.0对试验数据进行分析，其中，采用ANOVA比较各浓度茎叶提取物处理后的结果在0.05水平上的差异性，采用t-test比较同一浓度下绿薄荷茎和叶提取物处理后的结果在0.05水平上的差异性。2、结果与分析2.1绿薄荷提取物对小菜蛾幼虫体内AchE活性的影响2.1.1绿薄荷茎提取物对小菜蛾AchE活性的影响由表1可知，12、36、48h各浓度的绿薄荷茎提取物对幼虫体内AchE活力均表现出抑制作用。12～24h处理后小菜蛾体内AchE被激活，酶活力增加，其中，12.5mg/mL在24h时酶活力高于对照组；随着时间的增加，24h后各处理组开始下降，且低于对照组，表明随着时间的增加，绿薄荷茎提取物在小菜蛾体内产生抑制Ach水解生成胆碱的物质，降低了幼虫的解毒能力。表1绿薄荷茎提取物对小菜蛾幼虫体内AchE活性的影响2.1.2绿薄荷叶提取物对小菜蛾AchE活性的影响绿薄荷叶提取物对小菜蛾幼虫体内AchE活性的影响如表2所示。表2绿薄荷叶提取物对小菜蛾幼虫体内AchE活性的影响从表2可以看出，绿薄荷叶提取物浓度越高对小菜蛾体内AchE活性抑制作用越强。12～24h，处理后小菜蛾体内AchE被激活，其中，12.5mg/mL在24h的酶活力高于对照组；从24h开始处理组酶活下降，各浓度均低于对照。表明随着时间的增加，绿薄荷叶提取物在小菜蛾体内产生抑制Ach水解生成胆碱的物质，降低了小菜蛾幼虫的解毒作用。2.1.3绿薄荷茎和叶提取物对小菜蛾AchE作用比较由图1可知，在12h低质量浓度（12.5、25.0mg/mL）下的绿薄荷茎提取物对小菜蛾幼虫体内AchE活力高于叶提取物，而50.0、100.0mg/mL质量浓度下，二者无差异；24h时4个不同质量浓度条件下均表现出茎的酶活力高于叶，表明叶提取物对小菜蛾幼虫体内的AchE作用更强；36h时，在12.5、50.0mg/mL质量浓度下，叶提取物的作用强于茎，但在25.0、100.0mg/mL质量浓度下，效果则相反；48h时仅50.0mg/mL质量浓度下，绿薄荷茎提取物的酶活力低于叶，而其他3个浓度相反。浓度越大酶活力越低且同浓度下叶提取物作用后虫体的酶活力比茎的小，表明绿薄荷茎和叶提取物对小菜蛾幼虫体内的AchE活力的激活或抑制作用存在一定的差异。2.2绿薄荷提取物对小菜蛾幼虫体内CarE活性的影响2.2.1绿薄荷茎提取物对小菜蛾CarE活性的影响从表3可以看出，各浓度处理后，虫体的酶活力均为先增高后降低，在24h时，酶活力最高，且浓度越高，抑制作用越强，仅48h时，100.0mg/mL的酶活力高于50.0mg/mL。其中，在36h100.0mg/mL表现出最强的抑制作用，可能是由于浓度越高，小菜蛾取食量减少，虫体内累积的有效成分变少，酶活力降低，抑制作用增强。在48h时处理组的酶活力均低于对照组，表明绿薄荷茎提取物对小菜蛾幼虫体内CarE活性表现出抑制作用。表3绿薄荷茎提取物对小菜蛾幼虫体内CarE活性的影响2.2.2绿薄荷叶提取物对小菜蛾CarE活性的影响由表4可知，24h时，取食绿薄荷叶提取物的小菜蛾幼虫体内的CarE活力均大于对照；48h时，取食绿薄荷叶提取物的小菜蛾幼虫体内的CarE活力均小于对照，表明在24～48h绿薄荷叶提取物在小菜蛾体内发挥药效作用，抑制CarE活力。且在12～24h,12.5mg/mL处理后CarE活力剧增，表明受低浓度刺激后CarE被迅速激活。24h后各处理组的酶活力下降，而对照相反，表明绿薄荷叶提取物在虫体内发挥作用并抑制小菜蛾自身的解毒功能。表4绿薄荷叶提取物对小菜蛾幼虫体内CarE活性的影响2.2.3绿薄荷茎和叶提取物对小菜蛾CarE作用的比较由图2可知，12、36h时，12.5、25.0、50.0mg/mL处理组的虫体内CarE活力高于叶，100.0mg/mL时表现出叶强于茎；24h时，4个不同浓度下均表现出茎的酶活力高于叶；48h时，12.5、50.0mg/mL表现出叶的酶活力大于茎，而25.0、100.0mg/mL表现为茎的酶活力大于叶。2.3绿薄荷提取物对小菜蛾幼虫体内GST-s活性的影响2.3.1绿薄荷茎提取物对小菜蛾GST-s活性的影响由表5可知，12h处理组的酶活力均大于对照，且浓度越大酶活力越高，表明经处理后小菜蛾幼虫体内的GST-s被激活，浓度越高作用效果越强。24h时，50.0mg/mL处理的酶活力略大于对照，其余浓度均为处理组低于对照，表明随时间增加，绿薄荷茎提取物对小菜蛾产生了毒害作用，对其体内的GST-s开始产生抑制作用。36、48h的处理组酶活力均低于对照，表明虫体受绿薄荷茎提取物影响解毒能力减弱，可能是导致其病变、甚至死亡的原因之一。表5绿薄荷茎提取物对小菜蛾幼虫体内GST-s活性的影响2.3.2绿薄荷叶提取物对小菜蛾GST-s活性的影响绿薄荷叶提取物对小菜蛾幼虫体内GST-s活性的影响如表6所示。表6绿薄荷叶提取物对小菜蛾幼虫体内GST-s活性的影响从表6可以看出，12h处理组的酶活力均大于对照，表明绿薄荷叶提取物将幼虫体内的GST-s激活。24h时，12.5mg/mL处理的酶活力大于对照，其余浓度均表现出处理组低于对照，表明随着时间的增加，绿薄荷叶提取物对小菜蛾产生毒害作用，对其体内的GST-s开始产生抑制作用，影响到小菜蛾幼虫的解毒功能，浓度越高效果越强。36、48h表现出的处理组酶活力均低于对照，表明绿薄荷叶提取物对虫体内GST-s酶活性有抑制作用，36h绿薄荷叶提取物对小菜蛾体内GST-s活性抑制作用最强。2.3.3绿薄荷茎和叶提取物对小菜蛾GST-s作用的比较由图3可知，12h时，100.0mg/mL表现出的酶活力茎大于叶，其他浓度条件下均表现出叶的酶活力强于茎；24h时，12.5、25.0、100.0mg/mL的绿薄荷叶提取物的GST-s活力高于茎，50.0mg/mL表现出茎大于叶；36h时，100.0mg/mL表现出叶的酶活力大于茎，其他浓度条件下均表现出茎的酶活力强于叶；48h时，12.5、50.0mg/mL的绿薄荷叶提取物对小菜蛾幼虫体内的GST-s活力高于茎，而25.0、100.0mg/mL时茎的酶活力大于叶。3、结论与讨论昆虫在长期的进化过程中，逐渐在体内形成了具有代谢分解外来有毒物质的解毒代谢系统，其中重要的酶主要有乙酰胆碱酯酶（AchE）、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST-s)[27,28,35]。AchE通过催化神经递质乙酰胆碱的水解来阻止神经冲动，而CarE和GST可以增加昆虫对外源性化合物的代谢活性，从而发挥排毒作用。研究发现，花椒（ZanthoxylumbungeanumMaxim.）、野艾蒿（ArtemisialavandulaefoliaDC.）及艾蒿（ArtemisiaargyiH.）等植物提取物对小菜蛾体内AchE呈抑制作用[36]。苦豆子植物的生物碱对小菜蛾体内的CarE活力具有一定的影响[37]。野艾蒿提取物对小菜蛾体内GST-s活性也呈现抑制作用[38]。GAO等[39]的研究表明，经韭菜精油处理小菜蛾幼虫后，其体内GST活性降低，正常排毒代谢受到损害；CarE活性低于对照幼虫；而AchE活性是对照幼虫AchE活性的2倍。WEI等[40]研究发现，使用土荆芥精油的接触毒性剂量处理小菜蛾幼虫后，CarE和GST的活性被显著抑制。小菜蛾在取食有毒害植物时，体内的酶活性也会发生变化。为了研究毒杀作用的机制，本试验研究了3种酶的活性，结果表明，经处理后的小菜蛾体内AchE、CarE、GST-s活力均为先激活后抑制，处理组的酶活力显著低于对照，提取物浓度越高酶活力越低。表明绿薄荷茎、叶提取物作用于小菜蛾虫体后，解毒酶系的活力先被激活，适应和缓解有毒物质的作用，随着作用时间增加，酶活力降低，对毒害物质的代谢能力随之下降，最终致其死亡。这可能是由于小菜蛾体内产生了抑制解毒酶的物质或者是直接抑制了小菜蛾的解毒酶活性。有报道显示，不同浓度飞机草（EupatoriumodoratumL.）根、茎、叶提取物对美国白蛾（Hyphantriacunea(Drury））幼虫体内的解毒酶（CarE、AchE、GST-s）抑制作用也呈现出此趋势。随着时间的延长和绿薄荷提取物浓度的增加，小菜蛾体内解毒酶酶活逐渐降低，直至死亡。本研究与土荆芥（ChenopodiumambrosioidesL.）精油对小菜蛾幼虫体内的CarE活力影响规律一致[41]。前人对植物提取物相关的研究，均以茎叶混合提取，本研究分别对茎和叶的乙醇提取物的作用效果进行比较，且绿薄荷叶提取物对小菜蛾体内解毒酶的抑制作用比茎强[42,43]。本研究通过用不同浓度的绿薄荷茎叶提取物喂食小菜蛾3龄幼虫，测定虫体内主要的解毒酶活性。结果显示，茎、叶提取物对小菜蛾解毒酶系的作用均为先激活后抑制，随着时间的延长，小菜蛾出现死亡现象，这可能与体内的这几种解毒酶受抑制有关。参考文献：[10]徐晶晶,刘斌.基于DPPH､FRAP法的薄荷药材抗氧化谱效关系研究[J].北京中医药大学学报,2015,38(6):405-410.[13]周小露,刘丽明,管俊岭,等.茶刺蛾生物学特征及生物防治方法的研究进展[J].山西农业科学,2018,46(9):1581-1586.[14]王熠,张存莉,杨春,等.黑刺菝葜提取物对黏虫的拒食活性[J].山西农业科学,2018,46(9):1522-1524.[15]董红霞,王敬淑,刘光华,等.植物次生化合物在害虫防治中的作用[J].仲恺农业技术学院学报,2005(2):65-71.[16]俞瑞鲜,胡秀卿,吴声敢,等.几种植物精油对小菜蛾的趋避活性及其增效作用[J].浙江农业科学,2018,59(5):767-771.[17]孙永艳,桑晓清,张利平,等.薄荷属植物的杀虫活性[J].世界农药,2011,33(4):25-36,56.[19]康连森,邢晓轲,卫世乾.薄荷提取物的抗菌活性研究[J].南阳师范学院学报,2013,12(6):21-23.[20]刘航,迟德富,陈海一,等.双斑长跗萤叶甲对几种植物挥发物的触角电位和行为反应[J].林业科学研究,2013,26(4):488-493.[21]任建军,师光禄,谷继成,等.薄荷提取物对朱砂叶螨体内几种酶活性的影响[J].林业科学,2011,47(12):85-91.[21]吴兰军,李霜,谢佼昕,等.绿薄荷茎和叶的乙醇提取物对小菜蛾拒食和产卵忌避活性的影响[J].植物保护学报,2016,43(6):1007-1013.[27]田雪莲,尹显慧,龙友华,等.低剂量乙基多杀菌素对小菜蛾解毒酶的影响[J].农药学学报,2016,18(5):589-595.[28]尹飞,陈焕瑜,冯夏,等.乙基多杀菌素抗性小菜蛾代谢解毒酶酶活性研究[J].应用昆虫学报,2016,53(2):314-319.[29]朱香镇,雒珺瑜,张帅,等.植物源次生物质棉酚和芸香苷对绿盲蝽保护酶与解毒酶活性的影响[J].植物保护学报,2018,45(5):1044-1053.[30]王瑞龙,孙玉林,梁笑婷,等.6种植物次生物质对斜纹夜蛾解毒酶活性的影响[J].生态学报,2012,32(16):5191-5198.[32]陈立,徐汉虹,赵善欢.唐古特瑞香对斜纹夜蛾的拒食活性研究[J].华南农业大学学报,2000(1):44-46.[34]慕立义.植物化学保护研究方法[M].北京:中国农业出版社,1994:154-155.[36]孙红霞.植物精油对几种杀虫剂触杀毒力的影响及增效机理的研究[D].福州:福建农林大学,2008.[37]罗万春,张强.苦豆子生物碱对小菜蛾体内部分杀虫剂代谢酶活性的影响[J].昆虫学报,2003(1):122-125.[38]刘莹.野艾蒿精油对小菜蛾的生物活性及其作用机制研究[D].长春:吉林农业大学,2014.[41]李兵.土荆芥精油提取､成分分析及其对小菜蛾生物活性的研究[D].福州:福建农林大学,2007.[42]彭伟文,王英晶,陆丹倩,等.黑面神茎､叶不同提取物抑菌作用对比研究[J].中国医院药学杂志,2014,34(11):869-873.[43]奚广生,李海涛.人参茎叶､根部皂苷对桃蚜解毒酶活性影响及作用对比[J].江苏农业科学,2019,47(11):151-155.段雨,吴兰军,宋程飞,闫喜中,郝赤.绿薄荷茎叶乙醇提取物对小菜蛾幼虫解毒酶系的影响[J].山西农业科学,2020,48(09):1503-1509.基金:谷子病虫害绿色防控关键技术集成与示范(201804)。
