胃癌细胞迁移、侵袭和转移中原肌球蛋白4的作用分析近年来,虽然胃癌的发病率有所下降,但是其仍然是四大常见肿瘤之一,并且在肿瘤引起的死亡原因中排名第三[1,2,3,4,5]。肿瘤转移是患者死亡的主要原因,然而其详细机制,到目前为止,尚不明确[6,7,8,9];原肌球蛋白4是原肌球蛋白家族成员之一,广泛参与胚胎发育、细胞收缩及细胞分化等多种生命活动[10,11,12,13,14]。既往文献报道,TPM4在乳腺癌、宫颈癌、结肠癌等肿瘤组织中的表达明显低于癌旁正常组织,并且在肿瘤的转移过程中发挥着重要的作用[15,16,17,18]。也有部分学者报道,TPM4在恶性胶质瘤中表达增加,但其功能未做详细描述[19]。然而,其在胃癌组织中的表达如何,是否发挥作用,发挥什么样的作用,到目前为止,尚未见报道;本课题主要围绕TPM4在胃癌细胞的迁移、侵袭和转移过程中的作用展开研究。1、材料和方法1.1材料GC9811-P,SGC7901,GES,AGS细胞株来源于空军军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室。胎牛血清(fetalbovineserum,FBS),胰蛋白酶,DMEM培养基均购于Gibco公司。RNA相关试剂购于TaKaRa公司;Transwell购于Millipore公司。培养瓶,六孔板及24孔板购于Coring公司。Matrigel胶购于Sigma公司;TPM4上调、下调及空载体慢病毒由上海吉凯公司设计并合成。小鼠抗人原肌球蛋白4(Tropomyosin4,TPM4)购于Abcam公司。小鼠抗人β-actin抗体购于博奥森公司。FITC及HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体购于CellSignal公司。裸鼠购于空军军医大学实验动物中心。1.2方法1.2.1细胞培养将GC9811-P,SGC7901,GES及AGS细胞从液氮罐取出后,常规复苏,然后置于孵箱内培养,条件为:21%O2,5%CO2,37℃,含10%胎牛血清的DMEM培养基,24h后常规换液。待细胞生长达到80%～90%融合时,进行细胞传代。1.2.2稳定转染GC9811-P细胞接种于六孔板内,每孔约5×105个细胞,待细胞融合度达到50%～60%时进行慢病毒转染,具体操作步骤按吉凯公司所提供说明书进行。8h后,换成常规培养基,24h后,荧光显微镜下观察转染效率,72h后,冻存细胞和提取RNA及蛋白,用于后续实验。1.2.3Real-timePCR检测TPM4mRNA的表达根据TaKaRa公司所提供操作步骤,提取总RNA,反转录生成cDNA,保存于-20℃。利用cDNA为模板,于冰上合成PCR反应体系,反应条件为:95℃10min、95℃10s、60℃20s、72℃10s,37个循环。所需引物如下:TPM4正义5’-AGATGCTGAAGTTGGACAAGGAG-3’,反义5’-CCCTTTAGTTTCTTCTGGAGGTG-3’。β-actin正义5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’,反义5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCCA-3’。1.2.4WesternBlot检测TPM4的表达12%SDS-PAGE凝胶,20μg/泳道,蛋白电泳,结束后,切取含有TPM4分子量区域的凝胶,转膜,条件为:20V、30min;10%脱脂奶粉-1×TBST,室温封闭2h。小鼠抗人TPM4抗体(1∶200),小鼠抗人β-actin抗体(1∶1000),4℃,孵育过夜。次日,1×TBST洗涤5min×3次;5%脱脂奶粉-1×TBST稀释HRP标记二抗(1∶10000),室温孵育2h,1×TBST洗涤5min×3次,应用ECL化学发光液于成像仪内拍照分析。1.2.5免疫荧光检测TPM4的表达将TPM4表达上调、下调及空载体的GC9811-P细胞分别接种于ChamberSlideTM内。24h后开始实验,洗涤,1×PBS,3min×5次;加入1ml4%多聚甲醛,固定30min,再次洗涤,条件同上。山羊血清封闭液,封闭60min,倾去,勿洗,滴加一抗(1∶50),4℃孵育过夜。次日,倾去一抗工作液后洗涤,条件同上,滴加FITC标记的二抗(1∶100),避光孵育2h,洗涤。DAPI工作液(1∶500),孵育30min,洗涤,条件同上;抗荧光淬灭封片剂封片,避光保存于-20℃,择机行激光共聚焦观察及摄像。1.2.6Transwell实验实验前将各组细胞饥饿处理12h后,细胞计数,制备成2.5×105/ml的细胞悬液,24孔板内加入600μl含20%胎牛血清的DMEM培养基,将Transwell小室置于24孔板内后,加入200μl细胞悬液,常规培养24h。然后取出小室,倾去培养液,1×PBS洗3次,95%乙醇固定5min,0.1%结晶紫染色5min,再次洗涤,条件同上,晾干。显微镜下随意挑取10个视野拍照,取平均值并统计分析。1.2.7体内实验将TPM4上调、下调及空载体的稳转细胞系,制备成细胞悬液,细胞计数,最终浓度达5×106个/ml;整个实验分为三组,每组10只,固定裸鼠,通过尾静脉注射,200μl/只,60min后无异常,正常饲养。35天后,处理裸鼠,取出肝脏和肺脏,固定,包埋,染色,观察转移数目及大小。1.2.8苏木素-伊红染色石蜡切片常规脱蜡、水化后,苏木素染色10min,流水冲洗2h。0.5%伊红染色3min,梯度脱水,透明,中性树胶封片。1.3统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料以表示,多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。2、结果2.1TPM4在不同胃癌细胞系及胃癌组织中的表达降低利用Real-timePCR技术检测TPM4mRNA在不同胃癌细胞系及胃上皮细胞中的表达,结果显示,TPM4mRNA在胃上皮细胞中高表达,而其在不同胃癌细胞系中的表达均降低,程度不一,其中以GC9811-P细胞系的表达最低(图1A)。随后通过WesternBlot技术,检测TPM4蛋白在不同细胞系中的表达情况,结果与Real-timePCR基本一致(图1B),差异具有统计学意义(P<0.05)。再次通过免疫组化技术,检测其在胃癌组织及其匹配的癌旁正常组织中的表达情况,上述结果提示,TPM4在胃癌组织中的表达降低(图1C),并且其仅仅表达于细胞膜及细胞浆内,而细胞核无表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。但是TPM4在胃癌的发生、发展过程中,究竟发挥什么作用,目前并不是很清楚,因其在GC9811-P细胞系中的表达最低,后续所有的实验均使用此细胞系完成。2.2上调TPM4的表达抑制胃癌细胞的迁移及侵袭为了探索TPM4的功能,在GC9811-P细胞系中,稳定转染上调慢病毒(LV-TPM4)及其阴性对照(LV-NC),利用Real-timePCR技术检测其转染效率,结果显示,与阴性对照组相比,实验组TPM4的mRNA表达上调约7倍(图2A),通过Westernblot及免疫细胞荧光技术,检测其在蛋白水平的表达变化,二者与Real-timePCR结果基本一致(图2B、2C),差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明,TPM4过表达细胞系成功建立。通过Transwell实验检测TPM4过表达胃癌细胞的迁移及侵袭能力;结果发现,与阴性对照组相比,外源性上调TPM4的表达后,可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力(图2D、2E),差异具有统计学意义(P<0.05)。2.3下调TPM4的表达促进胃癌细胞的迁移及侵袭上述实验发现,在胃癌细胞中,外源性上调TPM4的表达后,可以抑制其迁移及侵袭功能。那么,干扰TPM4的表达后,是否可以促进胃癌细胞的迁移和侵袭?为此,再次在GC9811-P细胞系中,稳定转染干扰慢病毒(shRNA-TPM4)及其阴性对照(shRNA-NC),利用Real-timePCR技术检测转染效率,结果显示,与阴性对照组相比,实验组TPM4mRNA的表达下调了70%左右(图3A),通过WesternBlot及免疫细胞荧光技术,检测其在蛋白水平的表达变化,二者与Real-timePCR结果基本一致(图3B、3C),差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明,TPM4表达干扰细胞系成功建立。通过Transwell实验检测TPM4表达干扰的胃癌细胞的迁移及侵袭能力。结果发现,下调TPM4的表达后,可以促进胃癌细胞的迁移和侵袭能力(图3D,3E),差异具有统计学意义(P<0.05)。图1TPM4在不同细胞系、癌旁正常组织及胃癌组织中的表达图2上调TPM4的表达对胃癌细胞迁移及侵袭的影响图3下调TPM4的表达对胃癌细胞迁移及侵袭的影响2.4TPM4对胃癌细胞转移能力的影响上述实验仅仅在体外验证了TPM4具有抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力,那么其在体内是否具有同样的功能。随后,我们进行了体内实验,通过裸鼠尾静脉分别注射TPM4过表达、表达干扰及阴性对照的GC9811-P细胞悬液;通过苏木素-伊红染色,检测胃癌细胞在肺脏和肝脏的转移情况,结果显示,与阴性对照组相比,过表达组,其肺脏和肝脏所形成的胃癌细胞转移瘤数目及体积明显变小(图4A、4C);而干扰组,其转移瘤数目及体积显著增大(图4B、4D),差异具有统计学意义(P<0.05);上述结果表明,在动物体内,TPM4同样具有抑制胃癌细胞转移的能力。图4TPM4对胃癌细胞体内转移的影响3、讨论胃癌的发生、发展是多因素相互作用的结果[3]。到目前为止,转移仍然是其导致病人死亡的主要原因[9]。近年来,由于饮食习惯的改变,其发病率有所下降,然而生存率却没有得到显著性提高。因此,探索其转移的详细分子机制,寻找有效的治疗靶点,成为基础及临床上亟待解决的问题。TPM4基因定位于19号染色体,由8个外显子组成[20]。最早发现于非洲爪蟾蜍胚胎,属于原肌球蛋白家族成员之一[21]。ZhaoL等报道,在斑马鱼胚胎发育过程中,TPM4发挥着重要的作用,如果其缺失,导致心脏发育停止,然而详细的机制并不明确[10,22]。David等报道,TPM4通过与心肌细胞的细肌丝相结合,从而发挥其调控细胞收缩的特性[11,14,23]。最新文献报道,在乳腺癌、宫颈癌及结肠癌中,与癌旁正常组织相比,其在肿瘤组织中表达明显降低,并且其具有抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移,而且与患者预后密切相关[15,16,17,18]。然而,TPM4在胃癌组织中的表达如何,是否发挥作用,发挥什么作用?到目前为止,尚未见报道。我们的研究结果显示,与正常胃上皮细胞相比,TPM4在多种胃癌细胞系中的表达均有所降低,程度不一,其中以GC9811-P的表达最低;与癌旁正常组织相比,其在胃癌组织中的表达明显降低;为了进一步探索其功能,我们利用GC9811-P细胞系,通过慢病毒转染技术,分别建立了TPM4过表达及表达干扰细胞系,然后通过Transwell实验观察其是否参与胃癌细胞的迁移和侵袭,结果显示,过表达TPM4后,减弱胃癌细胞的迁移和侵袭能力;表达干扰TPM4后,增强胃癌细胞的迁移和侵袭能力;上述结果提示,TPM4具有抑制胃癌细胞迁移和侵袭等能力;然而,肿瘤细胞在体外和体内所处的生长环境并不完全相同,具有很大的差异性。为了探索其在体内是否可以发挥同样的作用,我们再次进行裸鼠体内转移实验,通过HE染色,检测其肺脏及肝脏转移瘤的数目及体积大小;结果显示,过表达TPM4后,无论是转移瘤的数目,还是其体积,均显著减少;而表达干扰TPM4后,其转移瘤的数目及体积明显增加。综上所述,本实验证实了TPM4在胃癌细胞系及胃癌组织中的表达降低,并且其具有抑制迁移、侵袭和转移的能力。然而其如何发挥抑制迁移、侵袭和转移的作用,目前并不清楚,需要进一步深入研究,这也是我们下一步工作中需要重点解决的问题。邓杰,赵志杨,刘午斌,曾文辉,阳莉,李著.原肌球蛋白4在胃癌细胞迁移､侵袭和转移中的作用[J].现代肿瘤医学,2020,28(17):2963-2967.
