氨基表面改性对不同比例的碳纤维增强聚醚醚酮种植体的性能及制备方法研究.docx

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氨基表面改性对不同比例的碳纤维增强聚醚醚酮种植体的性能及制备方法研究聚醚醚酮（PEEK）是一种高熔点、高强度、加工性能优异的全芳香族特种工程塑料，具有良好的化学稳定性和热稳定性[1]。1996年，FDA通过了PEEK可以作为椎间融合器材料植入人体，证实了PEEK良好的生物安全性[2]。目前PEEK已广泛应用于脊柱外科、骨折固定、关节置换[3]、整形外科骨缺损的修复[4]等。PEEK的弹性模量约为3～4GPa，与纯钛（110GPa）相比，更接近骨组织的弹性模量，可以避免应力遮挡效应，有效地将骨组织界面的应力均衡传递，维持骨结合界面的稳定，从而减少种植体颈部周围骨的废用性[5]。此外，PEEK是一种射线透射性材料，可避免金属植入物在进行影像学检查时产生的伪影[6]。然而，PEEK属于生物惰性材料，不利于其与周围的骨组织形成良好的骨结合，而且与金属种植体材料相比，PEEK的机械性能有待提高，从而限制了它的潜在应用。资料和方法1.材料：不同比例的（10%、20%、30%、40%,v/v）碳纤维增强聚醚醚酮（CF-PEEK）为直径1cm，厚度2mm的圆片（图1），由吉林大学化学学院提供，分别命名为10%CF-PEEK、20%CF-PEEK、30%CF-PEEK、40%CF-PEEK，其中10%CF-PEEK组和20%CF-PEEK组样品各26个，30%CF-PEEK组和40%CF-PEEK组样品各50个。所有样品表面经240目、600目、800目、1200目、2000目SiC水磨砂纸逐级抛光，分别用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗15min,50℃烘干箱干燥，储存于干燥皿中待用。图1碳纤维增强聚醚醚酮圆片2.力学性能检测：根据国家标准GB/T1039-1992，使用万能材料试验机（5944,INSTRON公司，美国）对不同比例CF-PEEK的力学性能进行检测，包括拉伸强度、弯曲强度、弯曲模量、弹性模量、断裂伸长率。每组检测5个样品，取其平均值。3.样品表面改性：样品进行低温等离子体表面改性，反应室开始放电前的基础压强小于1×10[3]，标准激发频率为13.56MHz。样品表面处理大致分二步：(1)氩气对材料表面的清洁和活化（连续波50W,10s，压强控制在5×10-2mbar);(2)在连续波（CW）和偶连脉冲（P）模式下烯丙胺对材料表面辉光放电等离子体改性（CW+P30%,4.8sccm），等离子体处理参数详见表1。氨基改性后样品分别命名为A-10%CF-PEEK、A-20%CF-PEEK、A-30%CF-PEEK、A-40%CF-PEEK。表1等离子体处理参数4.理化性能检测：扫描电镜（SEM,HitachiS-4800，日本）观察样品表面形貌；采用静态接触角测量仪（WCA,DSA20EKR譈SSGmbH，德国）检测样品表面的水接触角；X射线光电子能谱（XPS,ESCALAB250,Thermo公司，美国）检测样品表面化学元素组成，XPS光谱的获得通过单色Al的KαX射线源（20keV），各元素峰的校准依据C1s(C-C,C-H）元素峰定位在285.0eV处。5.氨基的标定与检测：利用4-三氟甲基苯甲醛（4-trifluoromethyl-benzaldehyde,TFBA）只与氨基反应的特性，三个氟原子标记一个初级氨基[7]，用TFBA对氨基进行标定2小时后，通过X射线光电子能谱仪对材料表面的C、N、O、F元素进行检测。6.成骨性能检测：(1)成骨细胞培养：MG-63成骨细胞采用H-DMEM完全培养液（10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素，89%H-DMEM）在37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育。待细胞生长至80%-90%时，胰蛋白酶消化，传代，每天换液。根据力学性能结果，30%CF-PEEK组和40%CF-PEEK组的力学性能相近且优于其他组，因此选取这两组样品进行成骨性能检测。所有样品实验前均紫外线照射30min。(2)DAPI染色：MG-63成骨细胞以2×10[4]个/孔的密度接种于24孔板中的样品表面，共培养6h后，使用磷酸缓冲液（PBS）冲洗3次，4%多聚甲醛固定10min,DAPI染料避光孵育10分钟，后弃液PBS充分清洗3次，每次5分钟，在荧光显微镜下观察细胞黏附。(3)扫描电镜观察：MG-63成骨细胞以2×10[4]个/孔的密度接种于24孔板中的样品表面，共培养6h后，使用2.5%戊二醛固定12小时。将样品用PBS冲洗3次，每次15分钟，乙醇梯度（30%,50%,70%,80%,90%,100%）各脱水10分钟，风干，喷金，进行扫描电镜观察。(4)CCK-8法检测细胞增殖：MG-63成骨细胞以1×10[4]个/孔的密度接种于24孔板中的样品表面，共培养1天和7天后，按10:1体积比加入CCK-8试剂，用酶标仪在波长450nm下检测其吸光光度值。(5)碱性磷酸酶活性检测：MG-63成骨细胞以1×10[5]个/孔的密度接种于24孔板中的样品表面，共培养7天和14天后，用PBS冲洗3次，加入0.1%TritonX-100于4℃冰箱中裂解40分钟，采用BCA试剂盒检测总蛋白量，ALP试剂盒检测ALP量，根据试剂盒说明书计算ALP活性。7.统计学分析：采用SPSS17.0统计软件分析，样本均数采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。结果1.力学性能：表2的力学性能检测结果显示，随着碳纤维含量的增加，复合材料的弯曲强度、弯曲模量、弹性模量都随之升高，断裂伸长率则随之降低，这说明材料由原本的韧性断裂逐渐转化为脆性断裂。当碳纤维的含量超过30%时，复合材料的拉伸强度开始下降。30%CF-PEEK组和40%CF-PEEK组的力学性能较相近，且优于其他组，因此选取这两种比例的复合材料进行生物学实验，以证实两组中具有最佳成骨性能的样品。表2不同碳纤维含量增强聚醚醚酮力学性能2.理化性能：(1)表面形貌：图2为不同比例碳纤维增强PEEK后的扫描电镜照片，可以看出，碳纤维与PEEK结合良好，因为是纳米级改性，所以氨基改性对样品表面形貌无明显影响。(2)水接触角：为探究氨基改性对样品亲水性能的影响，进行了水接触角检测。图3结果显示，不同比例CF-PEEK的水接触角在氨基改性后均显著降低（P<0.05），说明氨基等离子体改性明显提高了材料的亲水性能。(3)XPS分析：图4为不同比例CF-PEEK在氨基改性前、后，以及TFBA标定后表面化学成分的XPS分析结果。可以看出，CF-PEEK样品表面仅含有C和O两种元素，经氨基改性后表面可检测到N元素，而经TFBA标定后表面可检测到F元素，说明等离子体改性在各组样品表面均成功引入了氨基功能团。而且，根据图4C所示，30%CF-PEEK表面的F元素（2.66）多于40%CF-PEEK表面的F元素（2.31），说明30%CF-PEEK表面引入的氨基更多。3.成骨性能：(1)DAPI染色：如图5所示，30%CF-PEEK和40%CF-PEEK经改性后，成骨细胞的黏附量均明显增加，且30%CF-PEEK改性组表面细胞黏附最多，细胞荧光强度高，说明氨基改性显著促进成骨细胞的黏附。(2)细胞黏附形态：图6所示为MG-63成骨细胞在样品表面培养6小时的扫描电镜照片。细胞在30%CF-PEEK和40%CF-PEEK组样品表面呈梭形，经氨基改性后，表面的成骨细胞伸展较好，呈偏平状，板状伪足向材料表面伸展。(3)细胞增值能力：MG-63成骨细胞在样品表面培养1天和7天。1天时，30%CF-PEEK组样品改性后的OD值明显增加，40%CF-PEEK组样品改性后OD值略增加，但无统计学意义；7天时，30%CF-PEEK、40%CF-PEEK组样品改性后的OD值均明显增加。说明氨基改性可显著促进成骨细胞增值。(4)ALP活性：为探究氨基改性对成骨细胞分化的影响，进行了碱性磷酸酶（ALP）活性检测。培养7天时，30%CF-PEEK、40%CF-PEEK组样品经氨基改性后，ALP活性均显著提高；14天时，30%CF-PEEK改性组的ALP活性明显提高，但40%CF-PEEK组样品的ALP活性在氨基改性前后无明显差异。说明氨基改性对成骨细胞的早期分化有一定的促进作用。图2样品表面的SEM形貌（放大倍数×400)图3样品表面水接触角分析图4样品表面XPS图谱图5细胞在样品表面共培养6h后的DAPI染色图7细胞在样品表面共培养1、7天的CCK-8结果图6细胞在A:30%CF-PEEK,B:30%CF-PEEK改性讨论钛及钛合金存在金属腐蚀、钛离子释放、应力遮挡效应[8]等问题，聚醚醚酮因其良好的机械性能、可加工性和化学稳定性[1]，逐渐进入口腔种植学者的视线。Schwitalla等[9]采用静态压缩试验对PEEK的机械强度进行评估，结果显示PEEK的抗压强度为122.77MPa，可作为牙种植体承担咀嚼咬合力。然而研究发现，聚醚醚酮属于生物惰性材料，其骨结合能力和机械性能均弱于纯钛，限制了其临床应用[10,11]。低温等离子体表面改性技术，是在电流放电的高能量状态下，将挥发的气态的单体的化学键打断，在材料表面以共价键结合、重组，从而在表面形成结构和化学成分不同的活性功能层，该方法不改变材料基体的性质，能够对各种形状的表面进行处理，同时有较强的杀菌作用[12]。低温处理过程加上脉冲、占空比的引入可以激活单一的有机分子，同时不破坏它们基本的化学功能，使得产生稳定的、高度特异的、功能性的表面成为可能[13]。氨基具有良好的化学反应活性及带正电荷的表面，在生物化学中广泛应用于蛋白质等生物分子在水环境中的共价偶联[14]。本课题组前期研究结果表明，低温等离子体表面改性技术可以在纯钛表面引入稳定的、高密度的氨基功能团，显著促进了成骨细胞和神经胶质细胞在材料表面的粘附、增殖，提高了材料的成骨活性[7,15,16]。Zeng等[17]提出氨基功能化表面赋予骨支架材料良好的成骨性能。此外，碳纤维作为充填材料，可显著提高聚醚醚酮的弹性模量和硬度等机械强度[18]。力学性能检测结果显示，随着碳纤维含量的增加，复合材料的力学性能逐渐增强，30%CF-PEEK组和40%CF-PEEK组的力学性能较相近，优于其他组，因此选取这两种比例的复合材料进行生物学实验，进一步证实两组中成骨性能较好的、更加适合临床应用的一组。XPS分析结果表明，等离子体改性技术可以成功将氨基功能团引入CF-PEEK表面，且30%CF-PEEK表面引入的氨基多于40%CF-PEEK。氨基改性显著提高了材料的亲水性能，但对材料的表面形貌无明显影响。细胞的早期黏附是生物材料表面细胞增殖和分化的关键环节[19]。通过DAPI染色和SEM观察成骨细胞在样品表面培养6h后的黏附状态，结果发现经氨基改性后，细胞的伸展形态及黏附数量均明显增强。采用CCK-8法检测成骨细胞在样品表面培养1天和7天的增值能力，发现细胞在30%CF-PEEK改性组和40%CF-PEEK改性组的OD明显增高，氨基改性显著提高了细胞增值能力。这可能由于氨基带正电荷，与带负电的细胞膜表面产生静电相互作用，进而促进成骨细胞的黏附与增值。ALP是骨形成所必需的的酶，是成骨分化的早期标志物[20]。ALP活性检测发现，培养7天和14天后，成骨细胞在改性组样品表面的ALP活性明显强于未改性组，说明氨基改性促进成骨细胞的早期分化，但其作用机制有待进一步的研究。此外，生物学实验结果可以看出，40%CF-PEEK的成骨性能比30%CF-PEEK稍差，可能由于40%CF-PEEK表面引入的氨基略少于30%CF-PEEK，进而导致其表面的活性稍低，对成骨细胞的黏附、增值与分化的影响稍小。参考文献：[12]赵静辉,周延民,刘玉艳.纯钛表面氨基化改性对细胞生长的影响.口腔医学研究,2010,26(1):11-14.于婉琦,杨诗卉,张静洁,张海博,周延民,赵静辉.表面改性的碳纤维增强聚醚醚酮种植体的制备及其性能研究[J].现代口腔医学杂志,2020,34(04):219-223.基金:吉林省科技发展计划项目(20180101123JC);吉林省教育厅“十三五”科学技术项目(JJKH20190096KJ);吉林省卫生与健康技术创新项目(2018J072);吉林省发展和改革委员会项目(2019C051-2);吉林省中医药科技项目(2019036)。