用右旋雷贝拉唑钠注射的遗传毒性分析.docx

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用右旋雷贝拉唑钠注射的遗传毒性分析质子泵抑制剂是目前最有效的胃酸分泌抑制剂，广泛应用于胃食管反流和消化性溃疡的治疗[1,2,3]，第一个质子泵抑制剂为奥美拉唑，随后兰索拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑钠上市。右旋雷贝拉唑钠是雷贝拉唑钠的右旋光学异构体，其化学结构上含有手性基团，研究发现右旋体是雷贝拉唑钠中的主要活性成分，能特异性地抑制胃壁细胞H+、K+-ATP酶，从而有效抑制胃酸的分泌，主要用于治疗胃溃疡、反流性食管炎等[4,5,6,7,8,9]。目前对注射用右旋雷贝拉唑钠药效及机制研究的报道较多，对其毒理学研究报道较少。基于此，研究根据《药物遗传毒性研究技术指导原则》[10]，选用推荐的标准试验组合一中的细菌回复突变试验、体外细胞染色体畸变试验、小鼠体内微核试验3项标准试验，对注射用右旋雷贝拉唑钠的遗传毒性进行评价，以期为临床安全用药提供参考依据。1、材料与方法1.1菌株TA98、TA100、TA1535、TA97a和TA102购自美国MolecularToxicology,Inc。1.2细胞株中国仓鼠肺细胞（CHL）购自中国科学院上海生命科学研究院。1.3动物昆明小鼠50只，SPF级，体重30～40g，雄性，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，试验在屏障环境动物实验设施内进行，控制环境温度为20～26℃，湿度为40%～70%。1.4主要试剂注射用右旋雷贝拉唑钠，由山东省药学科学院提供；4-硝基喹啉-N-氧化物、2-氨基芴、1,8-二羟基蒽醌、环磷酰胺均购自Sigma；丝裂霉素C购自Roche；叠氮钠购自山东西亚化学股份有限公司；RPMIMedium1640basic培养基购自Gibco；新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；肝微粒体酶（S9）购自美国MolecularToxicology,Inc。1.5主要仪器AUW120D电子分析天平，日本岛津有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HFsafe-1500TE生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司；Thermo3111二氧化碳细胞培养箱，Thermoscientific公司；E100尼康显微镜，Nikon公司。1.6试验方法1.6.1细菌回复突变试验采用《药物遗传毒性研究技术指导原则》中推荐的5种菌株组合：TA98、TA100、TA1535、TA97a和TA102，对5株菌株分别进行组氨酸缺陷型（his）鉴定、脂多糖屏障缺陷（rfa）鉴定、uvrB修复缺陷型鉴定、R因子鉴定、四环素抗性鉴定、自发回变鉴定、对阳性致突变物反应性测定[10,11]，鉴定合格。代谢和非代谢活化条件下，每一种菌株均设5个剂量组，给药剂量分别为每皿1250、625、312.5、156、78μg，每组3个平行皿，同时设溶媒对照组和阳性对照组。试验采用标准平板掺入法，受试物处理48h后观察结果，计数每皿的回变菌落数。1.6.2体外染色体畸变试验CHL核型检查，畸变率<5%，荧光显微镜检查无支原体污染[10,12]。试验前一天，CHL接种于细胞培养瓶，每瓶（5～10）×105个，置37℃、5%CO2培养箱中培养。受试物6h作用组（代谢和非代谢活化条件）剂量分别为60、30、15μg/mL,24h作用组（非代谢活化条件）剂量分别为48、24、12μg/mL，同时设溶媒对照组和阳性对照组，阳性对照品代谢和非代谢活化条件下分别为环磷酰胺和丝裂霉素C[13]。各组收获前3～4h加入秋水仙碱溶液，制备染色体标本。各组至少观察300个分散良好的分裂中期相细胞，计数各组含有结构畸变染色体的细胞数并计算畸变率。1.6.3小鼠骨髓微核试验受试物高、中、低剂量分别为103、52、26mg/kg，同时设立溶媒对照组、阳性对照组（环磷酰胺，50mg/kg）。溶媒对照组、受试物各剂量组静脉注射给予相应给药制剂，阳性对照组腹腔注射给药，各组均单次给药，给药24～48h采样2次取胸骨制备骨髓涂片[10]。每只动物至少计数500个骨髓嗜多染红细胞（PCE）以确定未成熟红细胞[嗜多染红细胞（PCE）]占总红细胞[未成熟红细胞和正染红细胞（NCE）]的比例。每只动物至少计数4000个未成熟红细胞以测定未成熟红细胞的微核率。1.6.4数据处理试验数据进行平均数和标准差的计算，以均值±标准差（±s）表示，用SPSS软件统计分析。P>0.05表示差异无统计学意义，P≤0.05表示差异具有统计学意义。2、结果2.1鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验本试验中，在代谢活化和非代谢活化条件下，溶媒对照组中各试验菌株回复突变菌落数均在正常范围内，阳性对照组各菌株回变菌落数均高于溶媒对照组，有显著性统计学差异（P≤0.05），表明试验系统可靠。注射用右旋雷贝拉唑钠每皿1250μg剂量下，对菌株有明显抑菌作用（P≤0.05），每皿625μg剂量下有轻微抑菌作用（P≤0.05），每皿312.5、156和78μg剂量下无抑菌作用（P>0.05）（表1）。在每皿78～1250μg剂量范围内各剂量组回变菌落数与溶媒对照组相比均无显著性增加，且未呈现剂量反应关系，表明注射用右旋雷贝拉唑钠无诱导鼠伤寒沙门氏菌基因突变作用，鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验为阴性。2.2体外染色体畸变试验代谢活化和非代谢活化系统的条件下染毒6h，非代谢活化系统的条件下染毒24h，溶媒对照组染色体畸变率与阳性对照组比较，有统计学差异（P≤0.05），表明试验系统可靠。注射用右旋雷贝拉唑钠15、30、60μg/mL剂量下作用6h,12、24、48μg/mL剂量下作用24h，各剂量染色体畸变率与相对应的溶媒对照组比较，均无统计学差异（P>0.05）（表2），且未呈现剂量反应关系，表明注射用右旋雷贝拉唑钠无诱导CHL染色体畸变作用，体外染色体畸变试验结果为阴性。2.3小鼠体内微核试验阳性对照组的PCE/（PCE+NCE）比值与溶媒对照组比较无统计学差异（P>0.05),MNPCE高于溶媒对照组，有显著性统计学差异（P≤0.05），说明试验系统可靠。26、52、103mg/kg剂量下，2次采样小鼠PCE/（PCE+NCE）比值、MNPCE分别与溶媒对照组比较，均无显著性增加（P>0.05）（表3），表明注射用右旋雷贝拉唑钠在26～103mg/kg剂量范围内无诱发小鼠骨髓细胞嗜多染红细胞微核率增高的作用，小鼠体内微核试验结果为阴性。3、讨论右旋雷贝拉唑钠是新型质子泵抑制剂，对反流性食管炎、胃溃疡等有显著疗效，是主要药效活性成分，有较好的应用前景[14]。目前已有对右旋雷贝拉唑钠的药代动力学、毒理学等研究报道[15,16,17,18,19]，其中，遗传毒性研究报道中，评价的受试物为口服用右旋雷贝拉唑钠，对遗传毒性组合试验中的微核试验和染色体畸变试验进行了研究[20,21]。目前我国指导原则中遗传毒性试验推荐的标准试验组合为：(1)一项细菌回复突变试验；(2)一项体外中期相染色体畸变试验或体外微核试验，或一项体外小鼠淋巴瘤TK基因突变试验；(3)一项体内遗传毒性试验。因此，本试验以注射用右旋雷贝拉唑钠为受试物，采用细菌回复突变试验、CHL细胞体外染色体畸变试验、小鼠体内微核试验3项标准试验组合，对注射用右旋雷贝拉唑钠进行了体内和体外的整体详细遗传毒性试验研究。本研究的细菌回复突变试验，采用国内评价常用的5种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA1535和TA102菌株组合，对其进行基因型特性鉴定，经鉴定，5种菌株均为组氨酸缺陷型，具有rfa突变，其中TA97a、TA98、TA100、TA1535对紫外线敏感，不含R因子及pAQ1质粒，TA102具有野生型切除修复酶、含R因子及pAQ1质粒，5种菌株均鉴定合格，受试物设立5个剂量组，高剂量有一定的细菌毒性，研究了在代谢活化和非代谢活化平行条件下，受试物有无诱导基因突变的作用，结果显示，注射用右旋雷贝拉唑钠各剂量组细菌回复突变菌落数未显著增加，无诱导基因突变的作用，Ames试验结果为阴性。表1注射用右旋雷贝拉唑钠鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验结果表2注射用右旋雷贝拉唑钠染色体畸变试验结果表3注射用右旋雷贝拉唑钠小鼠体内微核试验结果（±s,n=5)体外哺乳动物细胞染色体畸变试验，因CHL细胞易在体外建立细胞系，试验条件易控制，自发突变率低，便于染色体分析[22]，故采用经鉴定无支原体污染、畸变率在历史背景范围内的CHL细胞进行了染色体损伤研究，受试物在代谢活化条件下分别染毒6h和24h，在非代谢活化条件下染毒24h，结果显示，代谢和非代谢活化条件下，注射用右旋雷贝拉唑钠各剂量组染色体畸变率与溶媒对照组比较，均无显著性增加，表明无诱导CHL细胞染色体畸变作用，试验结果为阴性。小鼠体内微核试验，本研究采用昆明小鼠，有较多的背景数据，也是微核试验常用的动物种属[23]，试验采用单性别雄性动物，给药起始年龄为6～8周龄，根据急性毒性作用结果，以约1/2LD50剂量作为高剂量[24]，给药后高剂量组动物有一定的毒性反应症状，如跳跃、步态不稳、俯卧不动，采用单次给药方案，给药后24～48h各组均胸骨骨髓采样2次，结果显示，受试物所检测剂量下无诱发嗜多染红细胞微核率增高的作用。3项试验均设立对应的溶媒和阳性对照，验证了系统的可靠性，对受试物的评价，均采用最大给药剂量，充分暴露其毒性。结果表明，在本实验条件和剂量范围内，未发现注射用右旋雷贝拉钠的遗传毒性作用。参考文献：[8]林晓冬,刘娜,刘纯,等.右旋雷贝拉唑钠对大鼠消化性溃疡的药效研究[J].食品与药品,2018,20(5):362-366.[9]桂元,王砾,詹继东,等.右旋雷贝拉唑钠对反流性食管炎模型大鼠炎性因子及血管活性肠肽的影响[J].胃肠病学和肝病学杂志,2017,26(5):539-542.[10]国家食品药品监督管理局.药物遗传毒性研究技术指导原则[S].国家食品药品监督管理总局,2018:4,22-26,31-33.[11]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].2003:189-199.[12]袁伯俊,廖明阳,李波.药物毒理学实验方法与技术[M].北京:化学工业出版社,2007:268-271.[15]戴晓莉,戴学栋,郭峰,等.注射用右旋雷贝拉唑钠大鼠13周重复给药毒性研究[J].中国药物警戒,2016,13(7):389-393.[16]刘翠玲,戴晓莉,马玉奎,等.注射用右旋雷贝拉唑钠Beagle犬13周重复给药毒性实验研究[J].中国药物警戒,2017,14(8):453-456.[20]张海艇,齐霞.右旋雷贝拉唑钠对动物体内染色体损伤的影响实验研究[J].药学研究,2014,33(7):384-405.[21]苏军,齐霞,张海艇.右旋雷贝拉唑钠对CHL细胞染色体畸变的影响实验研究[J].中国药事,2015,29(8):865-869.[22]贾庆文,英永,马会,等.体外染色体畸变试验染色体标本制备的质量控制[J].中国比较医学杂志.2018,28(4):108-112.[23]刘泳廷,刘佳,高敏,等.贵州鲜铁皮石斛粉小鼠急性经口毒性和骨髓红细胞微核试验研究[J].中国卫生工程学,2019,18(2):182-184.[24]彭双清,郝卫东.药物安全性评价关键计数[M].北京:军事医学科学出版社,2013:236-237.高梅,马会,陈凯,张岱州.注射用右旋雷贝拉唑钠的遗传毒性评价[J].中国药物警戒,2020,17(09):559-563.基金:中央引导地方科技发展专项“创新药物临床前评价公共服务平台”(CXLC161906).