达原饮治疗儿童新型冠状病毒肺炎引起发热的作用机制研究达原饮为明·吴又可《温疫论》中治疗温病邪伏膜原的经典名方,在临床上应用较为广泛,笔者曾有幸师从全国名中医张士卿教授,学习总结张士卿教授应用达原饮治疗儿童发热的经验,在10余年的临床工作中,应用达原饮治疗儿童发热,尤其是病毒感染引起的发热疗效显著。临床研究表明,达原饮最常用于湿热秽浊、郁伏膜原引发的发热症状[1,2],同时既可治疗感染性疾病的发热,还可治疗不明原因的高热和低热等[3]。目前,新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球爆发,儿童和婴幼儿作为易感人群,感染报告病例逐渐增多,防控形势严峻。儿童COVID-19症状虽不典型,但其病机与成人基本相同,主要为湿、热、毒、瘀郁阻肺络所致,在早期多为湿毒蕴肺证,湿毒伏于膜原而困脾闭肺,从而出现一系列相关临床表现[4]。因此在早期应用达原饮开达膜原、驱除湿毒疫邪,可防止邪气进一步侵犯人体。本文主要通过网络药理学的方法建立达原饮治疗发热相关靶点的数据库,分析相关疾病的通路,并探讨达原饮治疗儿童COVID-19引起发热的相关作用机制。1、方法1.1达原饮化合物及作用靶点的确定1.2发热相关靶点的确定1.3达原饮治疗发热相关靶点的确定将达原饮作用靶点与发热相关靶点进行比较分析,取二者交集,即为达原饮治疗发热相关靶点。1.4达原饮关键靶点蛋白相互作用(PPI)网络构建在STRING:功能性蛋白质关联网络数据库(STRING:functionalproteinassociationnetworks)(http://string-db.org/)中录入达原饮治疗发热的相关靶点,在“organism”中选择“homosapiens”进行检索,获得蛋白相互作用关系等生物信息。筛选出关键靶点,将关键靶点数据导入网络可视化工具Cytoscape3.7.2软件构建PPI网络图。1.5达原饮中药-关键靶点-化合物网络构建将达原饮的关键靶点对应的化合物与中药采用Cytoscape3.7.2软件进行可视化,构建中药-关键靶点-化合物网络图。1.6达原饮关键靶点富集采用R3.6.3软件对达原饮治疗发热关键靶点进行基因本体(geneontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)富集分析,并将分析结果的前20条进行可视化。1.7达原饮关键靶点-通路网络构建采用Cytoscape3.7.2软件将KEGG富集的前20条通路与关键靶点构建关键靶点-通路网络图。2、结果2.1达原饮中药化合物及靶点通过TCMSP以及BATMAN-TCM2个平台得到中药化合物及靶点,删去重复值以及无靶点的化合物,得到最终结果。达原饮中有7味中药,删除重复化合物及靶点,得到达原饮共有254个活性成分,1733个靶点。详见表1。表1达原饮每味中药中化合物及靶点个数2.2发热相关靶点在疾病基因数据库NCBI、OMIM、CTD、TTD中,查询到发热相关靶点共377个。2.3达原饮治疗发热相关靶点将检索到达原饮的作用靶点与发热相关靶点比较分析后取重复值,得到达原饮治疗发热相关靶点135个。详见图1。图1达原饮治疗发热相关靶点2.4达原饮关键靶点PPI网络有研究表明,COVID-19患者血浆中白介素-1β(IL-1β)、白介素-1RA(IL-1RA)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、重组巨噬细胞粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素γ诱导蛋白-10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-1A(MIP-1A)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、血小板衍生因子(PDGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)浓度均高于健康成人[5]。将筛选后得到的24个关键靶点,根据dgree值在cytoscape3.7.2软件中进行可视化。详见图2。其中达原饮的关键靶点与COVID-19炎症因子相关的靶点有10个相同靶点,每个炎症因子对应多个化合物。详见表2。表2COVID-19炎症因子的靶向次数图2达原饮关键靶点PPI网络图2.5达原饮中药-关键靶点-化合物网络中药-关键靶点-化合物网络总共包括149个节点(7个中药靶点、118个化合物节点、24个关键靶点节点)和480条边,其中绿色代表中药,紫色代表关键靶点,红色代表化合物,每条边则表示化合物分子与靶点之间的相互作用关系。详见图3。2.6达原饮关键靶点富集结果通过GO富集分析得到1895条(P<0.05),其中生物过程(BP)1870条,细胞组成(CC)14条,分子功能(MF)11条。详见图4、图5、图6。生物过程主要包括对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞对生物刺激的反应、活性氧代谢过程、脂多糖的细胞反应、细菌源性分子的细胞反应、细胞黏附的调节、白细胞-细胞黏附的调节、一氧化氮代谢过程、活性氮代谢过程、白细胞迁移、细胞对药物的反应、肽基酪氨酸磷酸化的调控、活性氧代谢过程的正调控、温度稳态,细胞组成主要与血小板α颗粒腔、膜区、细胞质囊腔、质膜外侧、质膜筏、吞噬杯、早期内胚层、内质网内腔等相关,分子功能主要与细胞因子活性、受体配体活性、生长因子活性、蛋白酶结合、整合素结合、肽酶激活剂活性、肿瘤坏死因子受体超家族结合、趋化因子活性等相关。KEGG富集得到114条通路(P<0.05),如图7所示。主要与AGE-RAGE信号通路、疟疾、IL-17信号通路、百日咳、类风湿性关节炎、炎症性肠病、人巨细胞病毒感染、甲型流感、TNF信号途径、肺结核、细胞因子-细胞因子-受体相互作用、乙型肝炎等相关。图3中药-关键靶点-化合物网络图图4GO分析BP图图5GO分析CC图图6GO分析MF图图7KEGG富集分析图2.7达原饮关键靶点-通路网络采用Cytoscape3.7.2软件将富集的前20条通路与关键靶点进行可视化,如图8所示。关键靶点-通路图中共有41个节点(20个通路节点和21个关键靶点节点)和180条边,其中紫色节点代表通路,红色节点代表关键靶点。图8关键靶点-通路网络图3、讨论明末疫病流行,吴又可根据临证所见,制定达原饮应用于湿热膜原病证的治疗,收到了良好疗效,此方一直沿用至今[6]。达原饮由槟榔、厚朴、草果、知母、白芍、黄芩、甘草组成,《温疫论·卷上》记载:“槟榔能消能磨,除伏邪,为疏利之药,又除岭南瘴气;厚朴破戾气所结;草果辛烈气雄,除伏邪盘踞,三味协力,直达其巢穴,使邪气溃败,速离膜原,是以为达原也。热伤津液,加知母以滋阴;热伤营气,加白芍以和血;黄芩清燥热之余;甘草为和中之用。以后四品,乃调和之剂,如渴与饮,非拔病之药也。”具有开达膜原、辟秽化浊的功效。COVID-19属中医学“疫病”范畴,《瘟疫论》云:“瘟疫之为病,非风、非寒、非暑、非湿,乃天地之间另有一种异气所感。”小儿脏腑娇嫩,形气未充,加之寒温不能自知,抵御外邪能力差,易外感六淫之邪及戾气。《瘟疫论》云:“此气(戾气)之来,无论老少强弱,触之者即病。”此次发病的儿童COVID-19早期主要表现为发热、干咳、乏力、大便秘结或便稀不爽、舌苔白厚腻,与吴又可描述的达原饮所治病证极其相似。并且达原饮在《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》第3～7版[7,8,9,10,11]、《儿童新型冠状病毒感染诊断、治疗及预防专家共识(第一版)》[12]中均为湿热蕴肺证的推荐处方,对COVID-19的疗效较好,可以明显改善患儿临床症状[13],对治疗儿童COVID-19发挥了重要作用。在儿科临床中,发热、炎性反应可由很多种原因引起,是儿童就诊最常见的原因,病毒感染引起的发热在儿科中最为常见。西医学认为发热的机制是致热原作用下或各种原因引起体温调节中枢功能障碍,体温升高超出正常范围[14]。与发热有关的细胞因子主要有白介素-1(IL-1)家族及IL-1受体拮抗蛋白、TNF-α、白介素-6(IL-6)、干扰素(IFN),其中TNF-α是介导炎性反应的主要细胞因子及抗肿瘤因子[15],是一种内源性致热源,可刺激下丘脑体温调节中枢及刺激巨噬细胞释放炎性介质[16];TNF-α能进一步诱导IL-6等细胞因子的产生,这些促炎性细胞因子参与体内急性反应、发热反应,引起趋化因子的释放等,还可使内皮细胞活化而导致血管通透性增加[17]。通过网络药理学研究表明,达原饮治疗发热主要是通过血管内皮生长因子A(VEGFA)、TNF、IL-10、IL-6、IL-1β、白介素-4(IL-4)等靶点,这些靶点主要通过参与炎症反应与调节免疫等过程来发挥作用。现代药理学研究表明,黄芩苷能升高雌激素受体-α(ER-α)水平,ER-α进一步与过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)相互作用,激活VEGF启动子的转录因子结合位点,有效诱导VEGF的表达和血管生成[18];黄芩还能够发挥清热镇痛的作用,主要是由于黄芩能够显著降低TNF-α、IL-1β等制热性细胞因子水平[19]。白芍提取物能够减轻过敏性皮炎症状,促进IL-4、IL-10的合成与释放,抑制IL-1β、TNF-α、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达,从而发挥抗炎、镇痛效果[20]。通过富集分析发现,达原饮在生物过程中参与一氧化氮代谢、温度稳态等过程,分子功能主要与细胞因子活性、TNF受体超家族结合、趋化因子活性等相关;富集到排名最前面的通路是糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路,其次是IL-17信号通路、TNF信号通路以及炎症等相关通路。AGE-RAGE信号传导途径与炎症密切相关。该通路可激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)途径,影响免疫和氧化应激反应[21]。在生理状况下,AGE-RAGE信号通路激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶后,产生大量的活性氧,激活MAPK、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和P38蛋白(P38)等介导的信号通路,使NF-κB发生磷酸化而活化,促进肾脏细胞释放多种趋化因子、炎症因子及黏附因子的释放,如单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白介素-1(IL-1)、胞间黏附分子-1(CAM-1)、TNF-α等,从而导致机体损伤[22]。TNF-α是一种非常重要的炎症因子,在炎症反应中发挥了十分重要的作用。TNF-α在感染部位通过促进血管内皮细胞的表达,刺激白细胞介素和趋化因子的生成,诱导白细胞在炎症部位大量聚集,促使TNF-α对炎症部位细菌体进行清除[23]。此次COVID-19主要以发热、干咳、乏力为主要表现,少数患儿表现为鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状,部分患儿表现为呕吐、腹泻等消化道症状或仅表现为精神弱、呼吸急促[11],同时伴随着多种细胞因子水平的升高,包括IL-1β、IL-6、IL-10、INF-γ、TNF-α、VEGF等[24],与达原饮治疗发热的关键靶点基本吻合。由此可推测达原饮可能是通过IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、VEGF等多个靶点作用于多条通路来治疗COVID-19所致的发热以及炎症反应。综上所述,达原饮可能通过IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、VEGF等多个靶点作用于AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路等多条信号通路,发挥抗炎及解热作用。本研究仅从数据分析角度进行预测,仍存在很多不足,需要进一步从细胞和分子层面进行实验验证,从而为达原饮治疗儿童COVID-19的临床和基础研究提供支持。参考文献：[1]王敏.达原饮加味临床应用体会[J].中国民族民间医药,2012,21(9):34.[2]戎兆赢,杨健,王玉林,等.系统药理学对方剂达原饮的物质基础及作用机制研究[J].中国医院药学杂志,2019,39(12),1227-1233.[3]彭鑫,汤尔群.达原饮在疫病治疗中的运用[J].中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