膝痹病关节软骨中金属基质蛋白酶及抑制剂表达分析膝关节骨性关节炎(KOA)属中医学“膝痹病”范畴,研究发现基质金属蛋白酶(MatrixMetlloproteinases,MMPs)[1,2]在KOA发病机制中起重要作用。郑素明等[3]将MMP1和MMP13用于KOA中医证型研究。Yang等[4]发现关节软骨压力负荷增加可激活MMP9,能降解基底膜的Ⅳ型胶原。同时,在重度退变关节软骨中,基质金属蛋白酶组织抑制剂2(TissueInhibitorofMetalloproteinases,TIMP2)[5]表达升高。本研究选取MMP1,MMP9,MMP13及TIMP2作为观测指标,对病变关节软骨行免疫组织化学染色,探讨KOA中医证候分型与MMP1,MMP9,MMP13及TIMP2之间的关系。1、研究对象与方法1.1研究对象2016年1月至2019年6月共收集本院骨科住院病人确诊为膝痹病(膝骨性关节炎)并行关节镜手术或者关节置换手术患者共90例,手术治疗前针对拟收集术中患者失去功能且完全剥脱的关节软骨,在术前谈话中明确告知每名患者及家属,并签署知情同意书,同时获本院伦理委员会批准。1.2诊断标准1.2.1西医诊断标准1)前1个月内有膝痛;2)X线示膝关节边缘骨赘;3)实验室检查符合骨性关节炎;4)年龄≥40岁;5)晨僵<30min;6)关节活动时有骨响声。满足1)2)或1)3)5)6)或1)4)5)6)即可确诊。1.2.2中医辨证标准综合参考《中药新药临床研究指导原则》[6]、《膝痹病(膝关节骨性关节炎)诊疗方案》及李文顺等[7]的临床研究。1)风寒湿痹证:膝关节酸楚疼痛、痛处固定,舌质淡,苔白腻,脉紧或濡。2)风湿热痹证:起病较急,病变膝关节红肿、灼热、疼痛,舌质红,苔黄,脉滑数。3)瘀血痹阻证:膝关节刺痛,痛处固定,舌质紫暗,苔白而干涩。4)肝肾亏虚证:膝关节隐隐作痛,腰膝酸软无力,舌质红、少苔,脉沉细无力。1.3纳入标准符合西医诊断标准,同时严格按照中医证候辨证分型诊断标准分组。1.4排除标准不符合骨性关节炎中西医诊断及分型标准者;膝关节肿瘤、结核、骨髓炎患者;合并其他系统严重疾病及精神病患者;研究者认为不宜参加临床试验者。1.5方法1.5.1试剂与仪器MMP1,MMP9,MMP13及TIMP2抗体购自ElabscienceBiotechnology公司。实验用其他仪器来自于三峡大学医学实验中心。1.5.2免疫组织化学法用链霉素抗生物素蛋白-生物素免疫染色法(S-P法)进行实验。1.6统计学方法数据应用SPSS20.0统计学软件分析,计数资料采用x¯±s表示,显微镜下(10×40倍)取3个不同视野中免疫组织化学法反应阳性细胞数所占细胞总数的百分率作为原始统计数据,计数资料用χ2检验,P<0.05差异有统计学意义。2、结果2.1一般资料根据中医膝痹病的辩证分型标准,将入组90例患者分为风湿热痹证20例,风寒湿痹证20例,瘀血痹阻证20例,肝肾亏虚证30例。风湿热痹证组:男9例,女11例;年龄(60.8±7.7)岁。风寒湿痹证组:男8例,女12例;年龄(59.7±8.3)岁。瘀血痹阻证组:男12例,女8例;年龄(59.7±8.2)岁。肝肾亏虚证组:男16例,女14例;年龄(62.5±8.3)岁。4组患者性别及年龄等一般资料经统计学处理,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。2.2观察指标比较实验各组MMP1,MMP9,MMP13及TIMP2阳性细胞数比较,见表1。表1实验各组阳性细胞数统计表(x¯±s)表1中MMP1,MMP9,MMP13阳性细胞表达率的变化趋势与本课题组前期测得患者血清和关节积液中SOD及MDA测定值变化趋势基本一致[8,9],TIMP2阳性细胞表达率的变化趋势与本课题组前期所测得患者血清和关节积液中NO测定值变化趋势基本一致[8,9]。这可以作为氧化应激及软骨细胞凋亡参与膝痹病(膝关节骨性关节炎)软骨基质降解的参考证据。MMP1,MMP9,MMP13及TIMP2阳性表达率在湿热痹阻证型组、寒湿痹阻证型组、瘀血痹阻证型组、肝肾亏虚证型组各组间差异有统计学意义(P<0.01)。实验各组MMP1,MMP9,MMP13及TIMP2阳性表达见图1-4。图1各证型MMP1阳性表达(×400)图2各证型MMP9阳性表达(×400)图3各证型MMP13阳性表达(×400)图4各证型TIMP2阳性表达(×400)3、讨论3.1关于测定指标的选择MMP1及MMP13能特异性降解Ⅱ型胶原。MMP1主要是作用于软骨的浅层,在OA发病过程中持续起作用。韦桂勇等[10]认为KOA早中期,关节软骨表层最先受损,MMP1主要表达于软骨非钙化层,呈进行性增多。MMP1能与Ⅱ型胶原上的MMP1裂解位点结合,使其降解,表达量明显上升。而MMP13作用于软骨的深层,在OA早中期起作用。MMP13降解Ⅱ型胶原的活性是MMP1的5～10倍,因此,MMP1及MMP13浓度变化最能反映出软骨基质中Ⅱ型胶原的代谢变化[11,12]。鲁海等[13,14]研究发现关节软骨压力负荷增加可激活MMP9,膝关节炎骨性关节炎患者关节液中的MMP9能够更早、更及时地反映OA的病理性改变。庞显伦等[15]和张贤杰等[16]认为,MMP9可作为OA早期检测诊断的一个重要指标。一旦胶原蛋白的三维螺旋结构被胶原酶所裂解,MMP9能够降解基底膜的Ⅳ型胶原等,可进一步降解已经变性的胶原或者明胶[17,18]。在重度退变关节软骨中MMP1和TIMP1表达减少,软骨细胞的死亡和数量减少是主要原因[19,20]。但TIMP2在重度退变软骨中较中度退变和正常软骨表达升高,相对于MMP2过量表达,这将抑制MMP2的功能发挥,致使其作用特异性底物Ⅳ型胶原降解受阻,出现器官纤维化增生和硬化,TIMP2和MMP13的平衡关系对于关节微环境、特别是软骨细胞的活性具有重要的意义[21]。重度退变关节软骨出现纤维化增生和硬化与此有关。3.2MMP1,MMP13,MMP9及TIMP2与膝痹病中医证候分型的关系本研究提示各证型组中MMP1,MMP9,MMP13及TIMP2阳性细胞表达率差异有统计学意义,变化趋势与本课题组前期关于氧化应激与各证型组变化的趋势基本一致[8,9],具有一定的理论意义。本实验研究提示MMP1,MMP9及MMP13阳性细胞表达率按照湿热痹阻证型组、寒湿痹阻证型组、瘀血痹阻证型组、肝肾亏虚证型组依次递减。TIMP2阳性细胞表达率按照湿热痹阻证型组、寒湿痹阻证型组、瘀血痹阻证型组、肝肾亏虚证型组依次递增。据以往文献研究,MMP1及MMP13主要反映细胞因子诱导的软骨基质Ⅱ型胶原纤维降解情况,MMP9主要反映关节软骨所受压应力所导致关节软骨Ⅳ型胶原纤维降解情况。TIMP2主要反映重度退变关节软骨出现纤维化增生和硬化。各证型组各项指标的变化趋势具有一定的临床意义,从另一个侧面证实了中医证候分型的客观存在及其科学意义。3.3MMP1,MMP13,MMP9及TIMP2对膝痹病中医宏观证候分型的指导意义中医证候分型是传统中医学依据疾病的宏观表现所归纳总结的结果,膝痹病的证候分型对膝痹病中医临床辨证论治有着绝对的指导意义。而MMP1,MMP13,MMP9及TIMP2是现代医学从微观分子生物学水平阐述膝关节骨性关节炎病理机制中具有代表意义的生化指标。本实验将两者结合起来探索发现,现代生化指标在证实传统证候分型客观存在的同时也对宏观辨证具有参考意义,反映细胞因子诱导的软骨基质Ⅱ型胶原纤维降情况的MMP1及MMP13表达水平越高,其临床症状越明显,多起病急、病程短,属风寒湿热证型居多;反映关节软骨所受压应力所导致关节软骨Ⅳ型胶原纤维降解情况MMP9表达水平越高,其临床症状多不明显,多起病缓慢,病程长,属瘀血痹阻、肝肾亏虚证型居多;反映重度退变关节软骨出现纤维化增生和硬化的TIMP2表达水平越高,其临床症状多复杂迁延,多病情反复,病程长,属肝肾亏虚、虚实夹杂证型居多。3.4MMP1,MMP13,MMP9及TIMP2与膝痹病中医证候分型之间的关系及思考现代医学微观生化指标和传统中医证候分型之间不是绝对的一一对应关系,同时中医证候分型也只是脏腑辨证分型。近期针对膝痹病的经筋分型研究颇多,本实验中反映关节软骨所受压应力所导致关节软骨Ⅳ型胶原纤维降解情况,MMP9多与其有关。同样,现代医学反映膝关节骨性关节炎的微观生化指标也绝非只有MMP1,MMP13,MMP9及TIMP2这四种。传统医学与现代医学,脏腑辨证和经筋辨证,微观与宏观之间的错综复杂的关系有待于进一步探索。总之,通过本实验笔者发现膝痹病各证型组关节软骨中MMP1,MMP13,MMP9及TIMP2的阳性表达能够为中医学宏观辨证提供参考依据。虽然其临床应用价值受到一定的限制,但是为膝痹病发生发展机制的探索及中医临床宏观辨证提供了有价值的参考依据,具体的对应关系值得进一步探索。参考文献：[1]刘娣,李春,马晓秀,等.温针灸对不同时间点KOA模型兔关节软骨中MMP-1､MMP-13表达的影响[J].辽宁中医杂志,2017,44(12):2652-2655.[2]龚志贤,卢敏,罗凌威,等.跌打通痹膏对兔膝骨关节软骨细胞MMP-1,MMP-3,MMP-13及COL-Ⅱ的mRNA表达的影响[J].中国中医骨伤科杂志,2016,24(9):1-4.[3]郑素明,关俊辉.膝骨关节炎不同证型软骨细胞在t-RNA中的表达[J].实用中西医结合临床,2016,16(2):28-30.[6]国家食品药品监督管理局.中药新药临床研究指导原则(试行)[M].北京:中国医药科技出版社,2002:350-352.[7]李文顺,沈冯君,易洪城.膝骨性关节炎的中医辨证分型与膝关节镜下病理改变对比性研究[J].中国骨伤,2003,16(7):13-14.[8]李秀成,胡华,杨桂英,等.膝关节骨性关节炎中医证候分型与血清中MDA､SOD､NO含量相关性研究[J].河南中医,2018,38(8):1221-1223.[9]李秀成,胡华,杨桂英,等.膝关节骨性关节炎中医证候分型与关节积液中MDA､SOD､NO含量相关性研究[J].实用疼痛医学杂志,2018,14(1):31-35.[10]韦桂勇,黄剑,郑玲玲,等.筋骨痹痛丸对家兔膝骨关节炎模型软骨细胞凋亡及mmp-1表达的影响[J].时珍国医国药,2014,25(10):2376-2378.[11]陆继鹏,舒钧,熊鹰,等.软骨下骨刚度增加对关节软骨Ⅱ型胶原和MMP-1表达的影响[J].国际骨科学杂志,2007,28(4):273-276.[12]熊鹏程,沈霖,熊昌源.三联疗法对兔膝骨性关节炎软骨MMP-1,MMP-13及TIMP-1mRNA的影响[J].中国中医骨伤科杂志,2009,17(3):9-12.[13]鲁海,卢超,张嘉良,等.膝骨性关节炎患者关节液中MMP-7､MMP-9､TIMP-1､TNF-α的表达及意义[J].中国医药科学,2015,5(22):11-15.[14]周伟,郑红波,冯穗,等.活血膏联合中药熏药治疗膝关节骨性关节炎的效果及对IL-1β､MMP-9的影响[J].中国医药导报,2018,15(27):117-121.[15]庞显伦,杨健,秦昊,等.人工关节炎性介质对滑膜细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响[J].中华实验外科杂志,2016,33(4):1052-1054.[16]张贤杰,王昌兴,王伟东,等.中医药治疗骨性关节炎与基质金属蛋白酶关系的研究进展[J].中国中医骨伤科杂志,2015,23(1):65-68.[17]马士超,陈秀民,齐志远,等.独活寄生汤对膝关节骨性关节炎行关节置换患者ESR､CRP､MMP-9水平的影响[J].陕西中医,2019,40(1):79-81.[18]庞青民,赵欲晓,王承惠,等.针灸联合独活寄生汤加减治疗膝骨性关节炎患者疗效观察及对炎症因子和血液流变学影响[J].辽宁中医杂志,2017,16(4):782-785.[20]李强,旷秋和,董小艳.新火针对家兔膝骨性关节炎基质金属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