胞内S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和 ER-α表达的关系医学论文.doc

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胞内S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和ER-α表达的关系_医学论文【摘要】目的探讨S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）升高抑制血管内皮细胞增殖和雌激素受体-α（estrogenreceptor-α，ER-α）基因表达变化的关系。方法以分离的原代人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC）为研究对象，经不同浓度的SAH水解酶强效抑制剂3-deazaadenosine（DZA）处理24～72h后，反相高效液相色谱法测定胞内SAH浓度，利用细胞计数法、流式细胞仪和TUNEL技术检测细胞的增殖凋亡能力，Westernblot法检测ER-α蛋白的表达，荧光定量-PCR检测其mRNA表达，甲基化特异PCR法检测ER-α基因启动子甲基化状态。结果经DZA处理后，HUVEC胞内SAH浓度升高（P＜0.05），生长增殖能力降低（主要受阻于G1/G0期），凋亡率增加（P＜0.05），ER-αmRNA和蛋白的相对表达量降低（P＜0.05），但DZA处理前后ER-α基因启动子甲基化状态不发生明显改变。结论SAH升高抑制HUVEC的增殖能力与ER-α的表达变化有关，但这种作用不是通过改变ER-α基因启动子的甲基化而实现的。【关键词】S-腺苷同型半胱氨酸人脐静脉内皮细胞雌激素受体-α甲基化Abstract：ObjectiveToexploretherelationshipofinhibitedproliferativeabilityinducedbyintracellularS-adenosylhomocysteine(SAH)accumulationandexpressionofestrogenreceptor-α(ER-α)inHUVEC.MethodsAfterisolatedprimaryHUVECtreatedwithout(normal)orwith3-deazaadenosine(DZA),apotentS-adenosylhomocysteinehydrolaseinhibitor,for24-72h,intracellularSAHlevelwasmeasuredwithreversedphasehigh-performanceliquidchromatography(RP-HPLC).TheproliferativeabilityofHUVECwasdetectedwithcytometry,flowcytometryandTUNELmethods.TheexpressionofER-αproteinandmRNAwasdeterminedwithWesternblotandquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(qRT-PCR)techniques,respectively.ThepromotermethylationofER-αgenewasanalyzedwithmethylationspecificPCR(MSP).ResultsTheresultsshowedthatthelevelofintracellularSAHwasincreasedinHUVECincubatedwithDZAcomparedtonormal.TheproliferativeabilityofHUVECweredecreasedandtheapoptoticratewasincreasedaftertreatmentwithDZA(P＜0.05).TherelativeexpressionofER-αmRNAandproteininHUVECtreatedwithDZAwaslowerthanthatofnormal(P＜0.05).ButtherewerenoobviouschangesofER-αgenepromotermethylationinHUVECbeforeandaftertreatmentwithDZA.ConclusionsThesefindingssuggestedthattheinhibitedproliferativeabilityinducedbyintracellularincreasedSAHwascorrelativewithER-αexpressioninHUVEC.Thisactionwasnotrelatedwithitspromotermethylatedpatterns.Keywords:S-adenosylhomocysteine;humanumbilicalveinendothelialcells;estrogenreceptor-α;methylation随着研究的深入，人们逐渐发现血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）与血管疾病间并不一定存在着必然的因果关系，蛋氨酸的另一中间代谢产物S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）可能是血管疾病的真正致病因素，而Hcy可能只是其中的一个伴随现象［1］。近年来人们研究证实，动脉粥样硬化（artherosclerosis，As）相关基因启动子甲基化的改变，导致其转录失调在As形成过程中拌演着重要的角色［2］。我们先前研究发现3-deazaadenosine（DZA）作为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的强效抑制剂，其应用在降低Hcy的同时，可以升高胞内SAH含量，降低DNA甲基转移酶1的表达，导致整体基因组低甲基化［3］。为了进一步阐明SAH升高促进As形成的机制，本研究探讨了DZA对HUVEC增殖的影响与ER-α基因表达变化及其启动子甲基化的关系。1材料和方法1.1主要试剂1640培养基干粉购于Hyclone公司；特级胎牛血清、DeathDetectionKit(POD原位细胞凋亡检测试剂盒)购于医学科学研究院生物工程研究所；SAH标准品和DZA购自Sigma公司；CytotoxicityDetectionKit购自(RocheMolecularBiochemicals公司；CycleTESTTMPLUSDNA试剂盒购自BDBiosciencesPharmingen公司；UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（CatDV811A）购自宝生物工程（大连）有限公司；GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒（Cat.GMS30005.2）购自上海杰美基因医药科技有限公司；EZDNAMethylation-GoldKit(tm)试剂盒（Cat.D5005）购自ZYMORESEARCHCORP公司。1.2细胞来源及分组取足月妊娠分娩后的新生儿脐带20cm，1.25g/L胰蛋白酶消化分离内皮细胞，1640培养基，10%胎牛血清，5％CO2，37℃常规培养传代［4］。考虑SAH不能直接通过哺乳动物的细胞膜，应用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂DZA阻断SAH向Hcy的转化，从而升高胞内SAH的浓度。实验分为以下4组：①对照组；②5μmol/LDZA处理组；③10μmol/LDZA处理组；④20μmol/LDZA处理组。处理时间分别为24、48、72h，对照组用等体积的灭菌双蒸水代替DZA。经CytotoxicityDetectionKit检测乳酸脱氢酶（LDH）释放量完全排除了DZA的细胞毒性作用。1.3反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定SAH浓度提取胞浆蛋白，Bradford法测蛋白含量后，按1∶1体积比加入等量三氯乙酸（100g/L，含4mmol/LEDTA·2K)，漩涡振荡混匀，4℃13000r/min离心10min。取20μl上清液上机分析胞浆SAH的浓度（nmol/mgprotein）。检测条件：美国Waters公司高效液相色谱仪，Empower色谱工作站，Waters1525BinaryHPLCpump高压泵，7125i进样器，Waters2966photodiodearraydetector紫外检测器；大连依利特HypersilBDSC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；柱温40℃；检测波长260nm；流动相50mmol/LNaH2PO4(pH=5.5)∶甲醇=9.5∶0.5,流速0.8ml/min；进样量20μl。1.4细胞生长曲线绘制以5×104个/ml密度接种HUVEC细胞于24孔培养板中，每孔2ml，分别加不同浓度的DZA干预培养1～4d，每天各取3孔，台盼蓝染色，显微镜下计数非染色的活细胞数，绘制生长曲线，并按如下公式计算细胞生长抑制率（GI）=（Nc-Nt）/Nc×100%，其中Nc和Nt分别为某一时相点对照组和处理组细胞数。1.5流式细胞仪检测细胞周期相分布按照BDBiosciencesPharmingen公司提供的CycleTESTTMPLUSDNA试剂盒说明书进行。细胞经处理后送至中山大学免疫教研室用BDFACScan流式仪（Macintosh操作平台，BDCellQuest1.0分析软件）分析细胞周期相分布。1.6TUNEL检测细胞凋亡按照DeathDetectionKit,POD原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。主要步骤：4%多聚甲醛溶液室温固定HUVEC30min，PBS洗片，与阻断剂（0.3%H2O2甲醇溶液）室温孵育30min，PBS洗片，加通透液（0.1%TritonTMX-100溶于0.1%枸鞣酸钠溶液）在冰浴中孵育2min，PBS冲洗2次，滴加50μl的TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃孵育60min，PBS冲洗3次，在荧光镜下分析结果并照相。1.7Westernblot法检测ER-α蛋白的表达按照GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒说明书进行。提取胞浆蛋白，Bradford法测蛋白含量后，取40g总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳并转移至聚偏(二)氟乙烯膜（PVDF），1%BSA的PBST（含5%tween-20的PBS缓冲液）封闭1h，1∶400稀释ER-α单抗4℃过夜，PBST漂洗10min×3，1∶40稀释生物素化二抗工作液，室温振摇1h，PBST漂洗10min×3，1∶40稀释HRP标记的链酶卵白素三抗工作液，室温振摇1h，PBST漂洗10min×3，DAB显色，照相并进行图象分析计算ER-α蛋白的相对表达量（正常组设为100）。1.8qRT-PCR法检测ER-αmRNA的表达HUVEC细胞经处理后送至中山大学达安基因有限公司检测ER-αmRNA的表达量。用TRIZol提取总RNA，取4μlRNA模板做逆转录成cDNA。内参β-actin采用RT-PCR荧光定量，ER-α采用巢式RT-PCR荧光定量。β-actin引物：Forward5’-GCGCGGCTACAGCTTCA-3’，Reverse5’-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’，探针序列5’-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGA-TAMRA-3’；ER-α外引物：Forward5’-TGCCAGGCTTTGTGGATTTG-3’，Reverse5’-GCCGCTGCATGACCTCCT-3’，内引物：Forward5’-TCTCGTCTGGCGCTCCAT-3’，Reverse5’-CTGGTTCCTGTCCAAGAGCAA-3’，探针序列5’-FAM-CACCCAGGGAAGCTACTGTTTGCTCCTAA-TAMRA-3’。所有引物由上海生工合成。ER-αmRNA的相对表达量为ER-α拷贝数与β-actin的拷贝数之比。1.9MSP法检测ER-α基因启动子甲基化按照UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（Cat.DV811A）说明书提取DNA，按照EZDNAMethylation-GoldKit(tm)试剂盒（CatalogNos.D5005）说明书步骤对DNA进行亚硫酸氢盐修饰。通过http://www.ucsf.edu/urogene/methprimer设计ER-α甲基化（M）和非甲基化（U）引物，由上海生工合成，其中甲基化引物：Forward5’-GAACGAGTTGGAGTTTTTGAATC-3’，Reverse5’-CCGATCTAACCGTAAACCTACG-3’，扩增片段171bp；非甲基化引物：Forward5’-GAATGAGTTGGAGTTTTTGAATTGT-3’，Reverse5’-AAAAACCAATCTAACCATAAACCTACA-3’，扩增片段176bp。该引物对应序列位于ER-α基因启动子的第二CpG岛（457bp-843bp）。扩增条件：94℃5min，94℃30s，59.5℃30s，70℃30s，40循环，最后70℃延伸10min。扩增产物2%凝胶电泳30min观察并照相。1.10数据处理用SPSS10.0软件进行统计学处理，数据用±s表示，采用Student’sｔ检验独立样本的差异性，least-squares法进行相关性分析，检验的显著性水平设在Ｐ＜0.05.2结果2.1胞内SAH浓度（图1）对照组细胞内SAH的浓度为4.32±0.65nmol/mgprotein，培养24,48,72h后，其含量处于一个相对稳定水平。但经DZA处理后，胞内SAH的浓度显著升高（Ｐ＜0.05），DZA的作用浓度越高、作用时间越长，胞内SAH含量增加越明显，提示DZA对胞内SAH浓度的增加效应具有时间和剂量依赖性。2.2HUVEC细胞生长增殖能力（图2）从HUVEC细胞的生长曲线反应DZA对血管内皮细胞生长增殖能力的影响。按公式计算结果显示DZA处理24～96h对HUVEC细胞的生长抑制率为24.1%～69.6%，相关性分析显示SAH浓度与细胞数存在负相关（r=-0.89,Ｐ＜0.001），提示胞内SAH升高能抑制HUVEC细胞生长增殖。2.3细胞周期相分布经三种不同浓度的DZA分别处理24,48,72h后，细胞周期相的百分比分布发生不同的变化，其中G1/G0期随着DZA浓度的增加和作用时间的延长，由正常对照的53.46±12.35%上升至58.21±13.24%～86.20±13.57%，S期由正常对照的35.19±8.96%下降至33.18±8.55%～8.10±2.46%，而G2/M期的变化无规律，提示胞内SAH升高主要使HUVEC细胞周期受阻于G1/G0期（Ｐ＜0.05），而S期减少（Ｐ＜0.05）。2.4HUVEC细胞凋亡结果（图3）利用TUNEL法检测细胞凋亡时，在荧光显微镜下观察到凋亡的细胞呈阳性。本实验中对照组可见少量荧光染色呈阳性的凋亡细胞，20μmol/LDZA处理24,48,72h后，荧光染色的强度逐渐增加，特别是作用72h后荧光强度最强，提示胞内SAH升高能使HUVEC血管内皮细胞产生凋亡。2.5ER-α蛋白表达（图4）Westernblot法检测ER-α蛋白的表达结果以PVFD膜上染色条带的深浅来判断蛋白表达的高低。实验结果显示，对照组染色条带最深，5,10,20μmol/LDZA处理24h后，染色条带强度逐渐减弱（图4A），图片分析结果显示ER-α蛋白的相对表达量（对照组设定为100%）随着DZA浓度的增加而降低（Ｐ＜0.01，图4B），SAH浓度与ER-α蛋白的相对表达量存在负相关（r=-0.92,Ｐ＜0.001），提示胞内SAH升高能抑制促增殖基因ER-α蛋白的表达。2.6ER-αmRNA表达（图5）不同浓度的DZA处理72h后，与对照组相比，HUVEC细胞ER-αmRNA的表达量显著降低，随着DZA浓度的增加，其表达量下降越明显（Ｐ＜0.05），SAH浓度与ER-αmRNA的表达量间也存在负相关（r=-0.88,Ｐ＜0.001），提示胞内SAH的升高能抑制ER-αmRNA的表达。图5荧光定量PCR检测ER-αmRNA表达（n=3）2.7ER-α基因启动子甲基化（图6）甲基化特异的PCR（MSP）引物有两对：一对是针对基因启动子CpG岛未甲基化序列的引物（U），另一对是针对基因启动子CpG岛发生甲基化序列的引物（M），因而两对引物中只有一对引物（U或M）能扩增，其MSP产物电泳结果只有一个亮带。对照组HUVEC细胞ER-α基因启动子第二CpG岛U引物未见扩增产物（176bp），而M引物的扩增产物在171bp处有一亮带，表明ER-α基因启动子第二CpG岛处于甲基化状态，经5,10,20μmol/LDZA处理72h后，其甲基化状态仍未发生改变，提示DZA并不能改变ER-α基因启动子第二CpG岛甲基化状态。3讨论血管内皮细胞损伤是As发生的早期病理特征。以往有研究发现血管内皮细胞功能的损伤，并不总是随着循环系统中总同型半胱氨酸浓度的增加而增加［2，5］。本研究结果显示，应用DZA升高了胞内SAH含量，细胞的生长增殖能力下降24.1%～69.6%（主要受阻于G1/G0期），同时凋亡率增加，SAH浓度与细胞数存在负相关（r=-0.89,Ｐ＜0.001），从而提示SAH升高能抑制血管内皮细胞的生长，SAH在As的形成过程中发挥着重要的作用。有关表遗传学中特异基因启动子甲基化导致其表达变化在肿瘤中报道较多，但在As中目前只有对ER-α、ec-sod及p53等少数几个基因的研究［6］，胞内SAH的升高抑制血管内皮细胞增殖是否与增殖基因ER-α启动子的甲基化而导致其表达有关，未见报道。雌激素受体（ER）属于核受体家族，有ER-α和ER-β两个亚型。在心血管疾病中对ER-α的研究较多，而对ER-β的研究较少［7］。KortelainenML等［8］用ER的单克隆抗体检测发现绝经前的女性中患有明显As者其表达降低，提示ER基因表达沉默与As形成有明显的相关性。近年来对已患有冠心病女性的随机研究表明雌激素替代疗法（HRT）对绝经后女性没有益处，且这种效应与脂质变化无关，提示可能有其他机制参与。为了探讨该机制，PostWS等［9］采用Southernblot方法研究表明在右心房中年龄相关ER-α基因甲基化增加，在静脉和动脉中能检测到ER-α表达，在As斑块中比正常邻近动脉ER-α基因甲基化明显增加，而在体外培养人动脉内皮细胞ER-α基因甲基化却保持较低。另外，在培养动脉平滑肌细胞（SMC）与As斑块中的SMC有相似的表型，ER-α基因甲基化水平较高（19%～99%），从而提示血管组织中ER-α基因甲基化致其表达失活在As形成和血管系统老化中发挥重要作用［10］。另有研究也发现ER-α基因甲基化与老龄化As呈明显相关性（r=0.36，Ｐ＜0.05）［9］。然而，本实验结果显示，对照组HUVEC细胞ER-α基因处于甲基化状态，其mRNA的表达量相对内参β-actin来说较低，胞内SAH升高对ER-α基因的甲基化状态没有明显的改变，但在转录和翻译水平降低了ER-α表达（r=-0.92,-0.88,Ｐ＜0.001），提示SAH升高对ER-α的调节作用不是通过改变启动子甲基化实现的，是通过何种途径还有待进一步的探讨。【参考文献】［1］FruchartJC,NiermanMC,StroesES,etal.NewRiskFactorsforAtherosclerosisandPatientRiskAssessment［J］.Circulation,2004,109(23Suppl1):15-19.［2］BrattstromL,WilckenDE.HomocysteineandCardiovascularDisease:CauseorEffect?［J］.AmJClinNutr,2000,72:315-323.［3］余小平，凌文华.胞内SAH升高对人脐静脉内皮细胞的损伤效应与DNA甲基化的关系［R］.中国博士后出站报告,中国广州，2006,12.［4］朱惠莲,夏敏,唐志红,等.人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察［J］.中国临床康复,2004,8(27):5834-5835.［5］EikelboomJW,LonnE,GenestJJ,etal.HomocysteineandCardiovascularDisease:aCriticalReviewoftheEpidemiologicEvidence［J］.AnnInternMed,1999,131:363-375.［6］余小平,张媛,凌文华.动脉粥样硬化DNA异常甲基化研究进展［J］.中国动脉硬化杂志,2006,14(1):70-72.［7］孙明晓，郭立新，周迎生,等.男性及绝经后女性雌激素受体基因多态性与糖尿病大血管病变的关系［J］.中国动脉硬化杂志,2004，12（2）：189-193.［8］KortelainenML,HuttunenP.ExpressionofEstrogenReceptorsintheCoronaryArteriesofYoungandPremenopausalWomeninRelationtoCentralObesity［J］.IntJObesRelatMetabDisord,2004,28(4):623-627.［9］PostWS,Goldschmidt-ClermontPJ,WilhideCC,etal.MethylationoftheEstrogenReceptorGeneIsAssociatedwithAgingandAtherosclerosisintheCardiovascularSystem［J］.CardiovascRes,1999,43(4):985-991.［10］HiltunenMO,Yla-HerttualaS.DNAMethylation,SmoothMuscleCells,andAtherogenesis［J］.ArteriosclerThrombVascBiol,2003,23(10):1750-1753.