增龄对大鼠海马NShc蛋白的影响临床医学论文.doc

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增龄对大鼠海马NShc蛋白的影响_临床医学论文作者：胡长春叶露梦朱婉儿【摘要】目的研究不同月龄大鼠海马NShc蛋白的表达，以及经氧化应激后NShc磷酸化水平的改变随年龄的增加而变化的规律。方法采用蛋白免疫印迹的方法，分别分析幼年组、成年组和老年组大鼠海马NShc蛋白的表达水平，以及经H2O2刺激后NShc磷酸化水平的改变。结果幼年组、成年组、老年组海马NShc蛋白的含量依次减少（P＜0.05），但成年组和老年组之间没有显著性差异；H2O2处理后，幼年组、成年组、老年组海马NShc蛋白磷酸化水平也依次减少（P＜0.01），而成年组和老年组之间无显著差异。结论随着年龄的增加，海马中NShc蛋白的表达逐渐减少并且NShc蛋白的活性逐渐降低。【关键词】增龄；NShc；海马；氧化应激增龄作为细胞的应激刺激，会引起一系列细胞内蛋白含量和功能的改变〔1〕。研究证明，细胞的氧化应激和细胞凋亡在机体衰老过程中起着重要作用〔2〕。NShc蛋白是近年来发现的Shc衔接蛋白家族的一员〔3〕。研究发现，在生理条件下NShc能增强细胞的抗氧化应激作用，抑制细胞凋亡，延长细胞寿命〔4〕。但NShc蛋白在神经细胞内的表达和功能是否受增龄的影响尚不清楚。本研究将大鼠海马NShc蛋白的表达以及氧化应激后NShc磷酸化水平的改变作为观察指标，通过观察其在不同月龄大鼠中的变化规律，探讨增龄对大鼠海马NShc蛋白含量和功能的影响。1材料与方法1.1动物与分组雄性SD大鼠，购于中国科学院上海实验动物中心。适应期7 d，自由摄食和饮水，室温24℃，光/暗周期分别为12 h(光照时间08:00～20:00)。其中分别取3、6、18个月龄大鼠为幼年组、成年组和老年组，每组5只。1.2试剂羊多克隆NShc抗体购于Santa Cruz公司；鼠单克隆抗NShc抗体、抗Shc抗体、抗Sck抗体购于Transduction实验室；抗磷酸酪氨酸(pTyr)单克隆抗体4G10购于Upstate Biotechnology Inc；其他相关试剂均购于Sigma公司。1.3方法1.3.1蛋白提取和定量大鼠在麻醉后断头，并在冰上分离出海马、嗅球、额皮质、后皮质、丘脑、下丘脑、小脑、脊髓、心脏、肝脏、肌肉组织。在冰浴中将组织标本置于1 ml裂解液中超声处理30 s，14 000 r/min离心30 s，取上清夜到0.5 ml离心管中，于-20℃保存。然后采用Bradford比色法进行蛋白定量。1.3.2 H2O2处理的海马组织分离和切片制作大鼠在无麻醉状态下断头，在冰上分离出海马，随后用McIlwain组织切块机从两个不同的方向制作厚度为300μm的切片；37℃条件下，切片在含氧的KR缓冲液中培养1 h，恢复生理活性；每一月龄组的每只大鼠海马切片分为4组：对照组只是培养在KR缓冲液中，其余3组分别在含有1 mmol/L H2O2的KR缓冲液中处理5、15和30 min。1.3.3免疫沉降取含有500μg蛋白的大鼠海马组织蛋白上清液，在冰上加适量羊多克隆NShc抗体反应1 h，随后与G蛋白琼脂混合，放在振动平台上反应一个晚上；次日以14 000 r/min离心30 s，弃去上清夜，沉淀物用PBS清洗两次，加入50μl 1/3 SDS2巯基乙醇上样缓冲液，于沸水中加热5 min，然后放入冰中冷却5 min后，取14 000 r/min离心，取上清夜作为电泳样品进行免疫印迹分析。1.3.4免疫印迹分析依照标准方法提取的蛋白，进行SDSPAGE电泳；然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用封闭液A（含5％脱脂奶粉的TTBS缓冲液，针对非磷酸化抗体）或封闭液B（含5％BAS的TBST缓冲液，针对磷酸化抗体）封闭1 h；按推荐浓度的第一抗体（鼠抗NShc抗体、鼠抗Sck抗体、鼠抗Shc抗体或抗pTyr抗体）室温下反应2 h，用TTBS 200 ml清洗3次；按推荐二抗(抗鼠IgGHRP)的浓度室温孵育1 h，然后同上清洗；最后加入发光底物后X光胶片感光30 min，经显影定影显现信号。1.3.5图象分析X光胶片经GS800 Calibrated图像光密度仪分析，测定目标带单位密度，并以正常对照的单位密度值为标准进行校正，定量分析磷酸化NShc蛋白和总NShc蛋白水平。磷酸化NShc蛋白量和总NShc蛋白量相除可得各个样本的磷酸化程度，所得数据除以相应月龄对照组（H2O2刺激0 min）的平均值作为NShc磷酸化含量。1.4统计学分析数据以x±s表示，SPSS13.0软件统计进行单因素方差分析，进一步的两两比较采用LSD检验。2结果2.1 Shc家族蛋白在大鼠神经系统及其他系统组织的表达大鼠NShc蛋白（包括p52 NShc和p64 NShc）和Sck蛋白的表达集中在神经系统各组织（包括嗅球、额皮质、后皮质、海马、丘脑、下丘脑、小脑和脊髓），在心脏、肝脏和肌肉组织中几乎没有表达；而Shc蛋白主要在心脏和肝脏中表达，见图1。2.2 NShc蛋白在不同月龄大鼠海马中的表达Western印迹分析发现3、6、18个月龄大鼠海马NShc蛋白水平分别为71.13±1.972、58.52±8.744、55.34±6.576，三组总体比较差异显著（F=8.468，P＜0.01），6和18个月龄组大鼠海马NShc蛋白的表达明显少于3个月龄组（P＜0.05），18个月龄组与6个月龄组大鼠相比有下降的趋势，但差异不显著。2.3不同月龄大鼠海马氧化应激后NShc蛋白磷酸化水平的改变重复测量单因素方差分析显示，氧化应激后三组大鼠海马磷酸化NShc蛋白的总体比较差异显著（F=25.083，P=0.000）。6个月龄组和18个月龄组大鼠海马NShc蛋白的磷酸化水平与3个月龄组相比有明显下降的趋势（P＜0.01）；而18个月龄大鼠海马NShc蛋白的磷酸化水平与6个月龄组相比有下降的趋势，但两组间没有显著差异，见表1。随着氧化应激时间的增加，3个月龄组大鼠海马NShc蛋白的磷酸化水平在0～5 min内快速上升，以后基本保持稳定，持续到30 min；6月龄组大鼠只在0～5 min内有轻微的上升，并且迅速下降；而18个月龄组大鼠在氧化应激后各时间点，NShc蛋白的磷酸化水平几乎没有变化。表1 NShc蛋白磷酸化水平3讨论本研究首先以3个月龄的大鼠为对象，观察NShc蛋白的表达情况，发现NShc蛋白表达主要集中在神经系统，在心脏、肝脏和肌肉组织中几乎没有表达；而Shc蛋白主要表达在心脏和肝脏中，与以往报道一致〔5〕。Conti L等的研究发现，神经系统Shc蛋白的表达与该区域细胞增殖的旺盛程度有关，细胞增生越旺盛，Shc蛋白表达越多，反之，若细胞增殖停止，则Shc蛋白几乎不表达〔6〕。本实验以3月龄SD大鼠为实验对象，推测其神经组织尚未完全发育成熟，还有少量Shc蛋白的表达。Shc家族蛋白包括Shc蛋白、Sck蛋白和NShc蛋白三种亚型，每种蛋白含有一个SH2磷酸酪氨酸基团（CH1）和一个名为PTB/PID区域的磷酸酪氨酸特异结合位点〔5，6〕。基因敲除实验和基因功能分析表明哺乳动物原癌基因Shc编码的p66Shc蛋白可能是联系凋亡和衰老的交汇点〔7〕。国外学者研究发现，Shc家族另一成员NShc也有着相似功能，它可以被脑源性神经营养因子（BDNF）活化发挥维持中枢神经细胞的存活和长寿的作用〔3，8〕。Pelcci的研究发现神经营养因子受体Ret可以刺激NShc蛋白的表达，并通过激活PI3K/Akt通路抑制细胞凋亡〔9〕。本研究显示，随着年龄的增加，海马NShc蛋白的表达呈下降趋势。在H2O2刺激浓度相同的条件下，NShc的磷酸化水平表达随年龄的增加而出现减少的趋势。NShc蛋白可以通过磷酸化起到保护神经细胞免受应激引起的细胞凋亡，Troglio等人的研究发现Shc基因缺陷的小鼠皮层神经元对H2O2刺激和缺氧的耐受能力明显降低〔4〕。因此，增龄导致NShc蛋白活性降低，对氧化刺激反应下降，可能就是增龄引起细胞凋亡的机制之一。本研究结果表明，随着增龄，大鼠海马中的NShc蛋白，无论是在正常生理状态下的表达水平，还是在氧化应激后的磷酸化改变，都出现减少趋势。这说明增龄会影响大鼠海马中NShc蛋白的含量和功能，导致活化的NShc蛋白的绝对量减少。这可能就是增龄所致神经退行性疾病发生的重要原因之一，尚有待于进一步研究。综上所述，NShc蛋白在神经细胞内的表达和功能受增龄的影响。大鼠海马NShc蛋白含量和功能的改变可能是增龄以及增龄所致神经退行性疾病的重要标志之一。【参考文献】1 Grune T，Jung T，Merker K,et al.Decreased proteolysis caused by protein aggregates，inclusion bodies，plaques，lipofuscin，ceroid，and′aggresomes′during oxidative stress，aging，and disease〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2004；36(12)：251930.2 Bruce R，Troen MD.The biology of aging〔J〕.Mt Sinai J Med，2003；70(1)：321.3 Nakamura T，Komiya M，Gotoh N,et al.Discrimination between phosphotyrosinemediated signaling properties of conventional and neuronal Shc adapter molecules〔J〕.Oncogene，2002；21(1):2231.4 Troglio F，Echart C，Gobbi A,et al.The Rai(Shc C)adaptor protein regulates the neuronal stress response and protects against cerebral ischemia〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2004；101(43)：1547681.5 Conti L，Sipione S，Magrassi L,et al.Shc signaling in differentiating neural progenitor cells〔J〕.Nat Neurosci，2001；4(6)：57986.6 Conti L，Defraja C，Gulisano M,et al.Expression and activation of SH2/PTBcontaining ShcA adaptor protein reflects the pattern of neurogenesis in the mammalian brain〔J〕.Proc Natl Acad Sci，1997；94(15)：818590.7 Purdom S，Chen QM.Linking oxidative stress and genetics of aging with p66Shc signaling and forkhead transcription factors〔J〕.Biogerontology，2003；4(4):18191.8 Bibel M，Barda YA.Nerurotrophins：key regulators of cell fate and cell shape in the vertebrate nervous system〔J〕.Genes Dev，2000；14(23):291937.9 Pelcci G，Troglio F，Bodini A,et al.The neuronspecific Rai(ShcC)adaptor protein inhibits apoptosis by coupling Ret to the phosphatidylinositol 3kinase/Akt signaling pathway〔J〕.Mol Cell Biol，2002；22(20)：735163.