肌苷对海人藻酸引起纹状体损伤的保护作用药学论文.doc

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肌苷对海人藻酸引起纹状体损伤的保护作用_药学论文【关键词】肌苷Protective effect of inosine on intrastriatal kianic acid injection induced lesion in the rat【Abstract】AIM:To establish the animal model of intrastriatal kainic acid(KA)injection and to investigate the effect of systematic administration of inosine on the striatal lesion size and the number of NADPHd positive neurons in this model.METHODS:KA was stereotaxically injected into the left striatum of rats.Ten rats were divided into 2 groups:Inosine group(n=5),receiving ip inosine administration,(50 g・L-1,75 mg・kg-1),3 times each day,from 1 day prior to operation to day 3 postoperatively when the rats were sacrificed,and control group(n=5),receiving normal saline instead of inosine.Nissl stain and NADPHd histochemistry were then performed to investigate the difference of lesion size and NADPHd positive neurons between inosine and saline treated groups.RESULTS:Inosine decreased the size of KAinduced striatal lesion area and increased the number of NADPHd positive neurons.CONCLUSION:Inosine can attenuate KAinduced striatal lesion and show protective effect on NADPHd positive neurons in the striatum.These findings provide a pontential clinical use of inosine in the CNS disease.【Keywords】kainic acid;inosine;corpus striatum;NADPHd positive neuron【摘要】目的：建立大鼠纹状体内注射海人藻酸（KA）模型，并观察肌苷对纹状体损伤面积及NADPH脱氢酶（NADPHd）阳性神经元数目的影响.方法：采用纹状体内注射KA制备模型.10只大鼠分成2组（n=5），分别于手术前1 d给予肌苷或等量生理盐水（对照组），腹腔注射，每日3次，持续给药至手术后第3日结束，利用尼氏染色和NADPHd的组织化学方法，观察肌苷组和对照组纹状体损伤面积及NADPHd阳性神经元数目的差别.结果：肌苷可以使KA引起的纹状体损伤面积减小并增加NADPHd阳性神经元的数目.结论：肌苷可以减轻兴奋性毒素KA引起的纹状体损伤，并对纹状体内的NADPHd阳性神经元具有保护作用.【关键词】红藻氨酸，肌苷，纹状体，NADPHd阳性神经元0引言肌苷在临床上被广泛地应用于各个领域，传统观点认为在中枢神经系统，肌苷是一种无活性的代谢中间产物，但是最近研究表明肌苷在体外可保护神经元免于损伤.史明等［1］发现，在用ZnSO4损伤PC12（一种常用的神经元模型）后，单纯给予肌苷即可提高PC12细胞的存活.由于兴奋性毒素的损伤是各种神经退行性疾患的一个重要的共同机制，因此，我们使用兴奋性毒素海人藻酸（KA）损伤纹状体模型［2］，探讨肌苷是否在体对兴奋性毒性引起的神经细胞损伤具有保护作用.1材料和方法1.1材料成年SD雄性大鼠10只(第四军医大学实验动物中心提供)，体质量250~300 g.利用日本Narishiga公司立体定向仪制作纹状体内注射KA模型.10只大鼠分成两组(n=5)，分别于术前1 d给予肌苷（50 g・L-1,75 mg・Kg-1）或等量生理盐水腹腔注射，每日3次.持续给药至术后第3日结束.1.2方法1.2.1纹状体内注射KA模型动物用10 g・L-1戊巴比妥钠50 mg・Kg-1，腹腔注射麻醉后，置于脑立体定位以上，常规皮肤消毒，正中矢状切开头皮，颅骨钻孔，依图谱在尾壳核前部（AP，0.7~1.0 mm；LP，3.0 mm；V，4.0 mm）5 min内用微量进样器徐缓注入1.0 g・L-1的KA或生理盐水0.5μL，并留针5 min后缓慢退出.1.2.2组织处理手术后，大鼠存活3 d，将动物麻醉，经左心灌注生理盐水100 mL，然后灌注0.1 mol・L-1 PBS配置的40 g・L-1多聚甲醛350 mL.1.5 h后取脑，并后固定3 h，再放入200 g・L-1蔗糖平衡溶液中，置于4℃冰箱中过夜.组织沉底后，于恒冷箱内切片，片厚40μm，分为5套.1.2.3组化染色和计数从5套切片中随即取出两套，分别作Nissl染色和NADPH脱氢酶(NADPHd)组化染色.NADPHd组化染色是将切片洗涤3次后，放入含NADPHd 1.0 g・L-1,硝基四氮唑蓝（NBT）100 mg・L-1和3 g・L-1 Triton X100的10 mmol・L-1的PBS(PH＝7.4)溶液中孵育1 h，染好后用10 mmol・L-1的PBS中止反应［3］.Nissl染色中的5个等距切片（200μm）被用来衡量KA的损伤面积，其中两个位于针道平面以前，两个位于之后，一个恰好位于针道平面.在BX60显微镜2倍目镜下采图，并于Photoshop6.0软件对其损伤区域进行描摹及计算.同样，NADPHd组化染色中的5个等距切片（200μm）被用来衡量肌苷对纹状体NADPHd阳性细胞数目的影响，我们使用损伤侧占对照侧纹状体NADPHd阳性细胞数目的百分数比作为衡量存活的指标.被检平面按照其距针道平面的距离依次为-400，-200,0,200,400μm（Tab 1）.统计学处理：使用SPSS软件进行student t检验.对于因方差不齐不能采用student t的数据，使用Wilcoxon(秩和检验)统计方法对其进行分析.2结果2.1尼氏染色手术后3 d，KA损伤侧纹状体明显萎缩，侧脑室扩大.损伤区较周围组织颜色浅淡，并与周围正常脑组织之间有一明显的分界线，易于区分.且在损伤中央切片上占据了大部分纹状体，但皮质未被累及（Fig 1A）.该区内大细胞神经元数目明显减少，但是胶质细胞增生明显.肌苷组与生理盐水组相比，损伤区域更小一些（Fig 1B）.定量分析证实肌苷组与生理盐水组比较，在被检的5个层面，损伤面积均有不同程度的减小（Tab 1）.2.2NADPHd组化染色KA损伤后，纹状体中心NADPHd神经元完全消失,NADPHd阳性神经纤维密度显著减低.NADPHd阳性神经元的减少和NADPHd阳性纤维密度减低，从损伤区中心至边缘呈渐变趋势.损伤区周缘残存的NADPHd阳性神经元,形态较单一,梭形者居多,胞体较小,神经纤维不连贯，断断续续，突起较少而短，NADPHd阳性纤维密度也较低.肌苷组与对照组相比，损伤区形态未见区别，但损伤区周缘残存细胞比例更高一些（Fig 2），在所检验的5个平面，残存细胞与对侧细胞数目的比值均有不同程度的提高（Tab 1）.图1尼氏染色Fig 1Nissl staining(略)图2NADPH脱氢酶阳性神经元(略)表1肌苷对KA引起的大鼠损伤面积及NADPHd阳性神经元数目的影响(略)3讨论通过本实验，我们证明了肌苷对KA局部注射引起的纹状体损伤有保护作用.在以前的实验中，肌苷被直接注射入CNS神经元的胞体处以促进其侧枝出芽［4］.但是在本实验中我们探讨了腹腔注射肌苷对CNS保护的可能性.这是因为，肌苷分子质量很小（268.3 ku）,易于透过血脑屏障［5］.而在KA损伤后，血脑屏障也失去其完整性［6］，因此，外周给予肌苷即可能可以对抗KA的毒性作用.我们的实验证实了这一点.关于肌苷对CNS保护作用的详细机制还不清楚.Litsky等［7］实验表明，肌苷可以在胶质细胞存在的前提下，提高神经元对呼吸链抑制剂鱼藤酮的抵抗能力.肌苷的这一作用被认为与胶质细胞内的嘌呤核苷酸磷酸化酶（Purine Nucleoside Phosphorylase,PNP）有关，PNP可以催化肌苷生成1磷酸核糖和次黄嘌呤（HX）.1磷酸核糖可以通过磷酸戊糖途径及糖酵解途径异生形成ATP，通过维持细胞内的能量代谢而提高神经元对外界损伤的抵抗力［8］.HX则可以在次黄嘌呤氧化酶催化下最终生成尿酸，而尿酸是过亚硝酸盐和体内其他氧化物的清除剂［9］.随着Benowitz等发现肌苷可以通过一些直接机制促进神经元突起的延伸［4］.关于寻找肌苷的新的作用靶点受到了研究者的重视.史明等［1］发现，肌苷可以在体外促进PC12细胞抵抗ZnSO4的损伤，而PC12细胞作为一种经常被使用的神经元模型，缺少PNP，因此，我们推测肌苷对神经元的保护作用可能由其他一些通路得以介导.而其中一个比较有可能的分子是PARP［Poly(ADPribose)polymerase］.Cosi等［10］的实验表明，纹状体内注射KA会引起24 h后纹状体PARP的内在活性及总活性的不同程度提高，从而提示PARP可能参与了兴奋性毒素对纹状体损伤的过程.PARP是DNA损伤修复中的关键分子，但是过度激活PARP，则因为大量消耗了细胞内的β烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）并进而使胞内ATP池耗竭，造成细胞的坏死性死亡.而肌苷因为与NAD+分子中的部分结构十分相似［11］，所以可与NAD+竞争结合PARP，因此可以作为一种PARP的竞争性抑制剂而发挥作用，从而阻止ATP的耗竭［12］.另外PARP的活性被肌苷抑制后还可阻止一氧化氮合酶的作用过程，使NO的合成量减少，结果使过亚硝酸盐生成减低，保护了细胞的膜性结构，从而提高细胞的存活［11］.通过上述讨论，我们可以看到，我们观察到的肌苷对纹状体NADPHd阳性神经元的保护作用可能是肌苷多方位作用的结果.与体外相比，有多种途径可能介导了肌苷在体对神经元的保护作用.而肌苷不仅容易获得，无副作用，并曾有报道肌苷可以顺利地透过血脑屏障，所以口服或肌注即可能对中枢神经系统产生作用.因此，在神经退行性疾病的早期，预防性的给予肌苷，有可能安全、方便的延缓神经退行性疾病的进程.【参考文献】［1］Shi M,You SW,Meng JH,Ju G,Direct protection of inosine on PC12 cells against zincinduced injury［J］.Neuroreport,2002;13(4):477-479.［2］Coyle JT,Schwarcz R.Lesion of striata l neurones with kainic acid provides a model for Huntingtons chorea［J］.Nature,1976;263(5514):244-246.［3］Oermann E,Bidmon HJ,Mayer B,Zilles K,Differential maturational patterns of nitric oxide synthaseI and NADPH diaphorase in functionally distinct cortical areas of the mouse cerebral cortex［J］.Anat Embryol(Berl),1999;200(1):27-41.［4］Benowitz LI,Goldberg DE,Irwin N.Inosine stimulates axon growth in vitro and in the adult CNS［J］.Prog Brain Res,2002;137:389-399.［5］Marangos PJ,Trams E,ClarkRosenberg RL,Paul SM,Skolnick P.Anticonvulsant doses of inosine result in brain levels sufficient to inhibit［3H］diazepam binding［J］.Psychopharmacology(Berl),1981;75(2):175-178.［6］Bolton SJ,Perry VH.Differential bloodbrain barrier breakdown and leucocyte recruitment following excitotoxic lesions in juvenile and adult rats［J］.Exp Neurol,1998;154:231-240.［7］Litsky ML,Hohl CM,Lucas JH,Jurkowitz MS.Inosine and guanosine preserve neuronal and glial cell viability in mouse spinal cord cultures during chemical hypoxia［J］.Brain Res,1999;821(2):426-432.［8］Haun SE,Segeleon JE,Trapp VL,Clotz MA,Horrocks LA.Inosine mediates the protective effect of adenosine in rat astrocyte cultures subjected to combined glucoseoxygen deprivation［J］.J Neurochem,1996;67(5):2051-2059.［9］Keller JN,Hanni KB,Mattson MP,Markesbery WR.Cyclic nucleotides attenuate lipid peroxidationmediated neuron toxicity［J］.Neuroreport,1998;9(16):3731-3734.［10］Cosi C,Cavalieri E,Carcererid P,Marien M,Suzuki H.Effects of kainic acid lesioning on poly(ADPribose)polymerase(PARP)activity in the rat striatum in vivo［J］.Amino Acids,2000;19(1):229-237.［11］Virag L,Szabo C.Purines inhibit poly(ADPribose)polymerase activation and modulate oxidantinduced cell death［J］.FASEB J,2001;15(1):99-107.［12］Endres M,Wang ZQ,Namura S,Waeber C,Moskowitz MA.Ischemic brain injury is mediated by the activation of poly(ADPribose)polymerase［J］.J Cereb Blood Flow 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