罗格列酮对内皮素引起心肌细胞损伤的保护作用及机制医学论文.doc

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罗格列酮对内皮素引起心肌细胞损伤的保护作用及机制_医学论文作者：朱肖星牛小麟魏瑾陈定章朱萧玲马晓涛高登峰郝广华李高中徐琳王文清【摘要】目的：以新生大鼠心肌细胞为模型，探讨罗格列酮(RSG)对内皮素1(ET1)引起心肌细胞损伤的保护作用及其机制.方法：将原代培养的心肌细胞分为5组:DMEM组,ET1组,ET1+RSG(10-9mol/L)组、ET1+RSG(10-8mol/L)组、ET1+RSG(10-7mol/L)组;培养24 h和48h,吸取培养液；按试剂盒说明书进行测定心肌细胞培养液中LDH,SOD活性及MDA含量.结果：药物干预24和48 h后,培养液中LDH的活性，ET1组均高于对照组（分别为P＜0.05,P＜0.01），ET1+RSG组均低于ET1组，其中10-8mol/L和10-7mol/L RSG+ET1组较ET1组降低有统计学意义（分别为P＜0.05,P＜0.01）；SOD活性：ET1组均低于对照组（分别为P＜0.05,P＜0.01），ET1+RSG组均高于ET1组，其中10-8mol/L和10-7mol/L RSG+ET1组较ET1升高有统计学意义（分别为P＜0.05,P＜0.01）；MDA含量：ET1组均高于对照组（分别为P＜0.05,P＜0.01），ET1+RSG组均低于ET1组，其中10-8mol/L和10-7mol/L RSG+ET1组较ET1降低有统计学意义（分别为P＜0.05,P＜0.01）.结论：RSG对内皮素引起心肌细胞损伤的保护作用及机制与抗氧化、降低氧自由基的产生有关.【关键词】罗格列酮，内皮缩血管肽1，心肌/细胞学【Abstract】AIM:To investigate the protective effect of rosiglitazone(RSG)on endothelin1(ET1)induced cardiomyocyte injury and its mechanism.METHODS:The cultured primary cardiomyocytes from neonatal rats were randomly divided into DMEM group(control group),ET1 group,ET1+RSG(10-9mol/L)group,ET1+RSG(10-8mol/L)group and ET1+RSG(10-7mol/L)group,respectively.The supernates were taken and detected before and 24 and 48 h after intervention for the levels of LDH,MDA and SOD with biochemical techniques.RESULTS:At 24 and 48 h,the level of LDH in ET1 group was higher than that in control group（P＜0.05,P＜0.01,respectively）,and also higher than those in ET1+RSG groups,especially 10-8mol/L and 10-7mol/L RSG+ET1 groups（P＜0.05,P＜0.01,respectively）.The activity of SOD in ET1 group was lower than that in control group（P＜0.05,P＜0.01,respectively）,and those in ET1+RSG groups,and particularly 10-8mol/L and 10-7mol/L RSG+ET1 groups were significantly higher than ET1 group in SOD activity（P＜0.05,P＜0.01,respectively）.The concentration of MDA in ET1 group was higher than that in control group（P＜0.05,P＜0.01,respectively）and those in ET1+RSG groups;10-8mol/L and 10-7mol/L RSG+ET1 groups were significantly lower than ET1 group in MDA concentration（P＜0.05,P＜0.01,respectively）.CONCLUSION:RSG protects cardiomyocytes from the ET1induced injury,which may be related to its antioxidant potential and depression of oxygen free radicals production.【Keywords】rosiglitazone(RSG),endothelin1(ET1),myocardium/cytology 0引言大鼠心肌细胞有内皮素特异性受体.在培养新生大鼠心肌细胞中，内皮素1(endothelin1,ET1)，可诱导心肌肥大、增加蛋白质的合成,是引起心肌肥大的因子［1］.随着ET1研究的深入,现已证实，ET1有引起心肌细胞损伤和心律失常的效应.高血压患者，ET1浓度的升高.PPARγ的激动剂罗格列酮(rosiglitazone,RSG)在动物实验中已发现可以通过降低高血压大鼠的血压、ET1的浓度和抗心肌肥大的作用［2］，但整体动物实验影响的因素较多，本实验采用培养大鼠的心肌细胞.我们研究PPARγ的激动剂RSG对ET1引起心肌细胞损伤的保护作用及其机制.1材料和方法1.1材料1~3 d龄新生SD品系大鼠乳鼠由第四军医大学实验动物中心提供.新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司生产；考马斯亮蓝G250由华美生物工程公司提供；高糖DMEM培养基、5′溴脱氧尿苷（Brdu）和ITS是GIBCO产品,ET1,胶原酶1均为Sigma公司的产品，RSG是Alexis公司的产品，LDH试剂盒、丙二醛试剂盒和SOD检测试剂盒均由南京生物工程研究所生产.1.2方法1.2.1新生大鼠心肌细胞的分离与培养参考文献［3］在无菌条件下取出乳鼠的心脏，剪碎，用胶原酶110 g/L消化成单细胞悬液，离心（1000 r/min,5 min）弃上清，加入含100 mL/L新生牛血清，0.1 mmol/L Brdu的高糖DMEM重新悬浮，孵育90 min，收集未贴壁细胞(95%以上为心肌细胞)用于实验.1.2.2分组将心肌细胞接种于24孔培养板［5×105细胞/(ml·孔）］，培养48 h,换含10 g/L ITS的无血清高糖DMEM培养液，24 h后每8孔为1组，随机分为对照组,ET1组,ET1+RSG(10-9 mol/L)组、ET1+RSG(10-8 mol/L)组,ET1+RSG(10-7 mol/L)组,培养24 h和48h,吸取培养液，于-20℃冻存待测.1.2.3心肌细胞培养液中LDH,SOD活性及MDA含量的测定按试剂盒说明书进行操作［4］.统计学处理：实验数据以x±s表示，多组间均数比较用单因素方差分析（ANOVA），均数间的多重比较用SNKq检验,，用Origin统计软件进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义.2结果2.1RSG抑制ET1引起LDH活性的升高ET1组，ET1+RSG不同浓度组给药前与正常对照组LDH活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05），ET1组24 h,48 h LDH活性较正常对照组增强，，差异有统计学意义（分别为P＜0.05,P＜0.01）.RSG减弱ET1引起LDH活性的升高，10-8 mol/L和10-7 mol/L RSG均可抑制ET1引起LDH活性的升高（P＜0.05，表1).表1RSG抑制ET1引起LDH活性的升高(略)2.2RSG恢复ET1引起SOD活性的降低ET1组，ET1+RSG不同浓度组给药前与正常对照组SOD活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05），ET1组24 h，48 h SOD活性较正常对照组减弱，差异有统计学意义（分别为P＜0.05,P＜0.01）.RSG可恢复ET1引起SOD活性的升高，10-8 mol/L和10-7 mol/L RSG均可恢复ET1所致的SOD活性的升高（P＜0.05，表2).表2RSG恢复ET1引起SOD活性的降低(略)2.3RSG抑制ET1引起MDA含量的升高ET1组,ET1+RSG不同浓度组给药前与正常对照组MDA含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），ET1组24 h,48 h MDA含量较正常对照组增加，差异有统计学意义（分别为P＜0.05,P＜0.01）.RSG减弱ET1引起MDA含量的升高，10-8 mol/L和10-7 mol/L RSG均可抑制ET1引起MDA含量的升高（P＜0.05，表3).表3RSG抑制ET1引起MDA含量的升高(略)3讨论ET1是含有21个氨基酸残基的血管活性多肽，它有调节细胞增生、促进血管和心肌重构的作用［5-6］，外源性ET1可以引起心肌缺血性损伤和心律失常.在整体动物实验中,ET1的效应不能区分直接还是继发于ET1缩血管产生的效应.本研究选用培养心肌细胞模型，在细胞水平观察ET1对心肌细胞的直接影响，排除了整体或离体心脏实验中ET1收缩血管的因素.内皮素作用心肌细胞后，细胞培养液中LDH活性的增加提示心肌细胞损伤，细胞内酶漏出，,培养液中SOD活性的降低和MDA含量的增加，SOD具有清除氧自由基和抗氧化损伤的能力，MDA是细胞脂质过氧化作用的产物.内皮素作用下，SOD活性降低和MDA含量增加，表明心肌细胞的抗氧化损伤的能力明显下降.RSG抑制内皮细胞产生ET1，体内、体外实验证明RSG有抑制心肌肥大的作用.我们证明RSG可以降低内皮素引起LDH的升高，说明RSG对心肌细胞有保护作用.RSG在高胆固醇血症中保护血管效应与抗氧化有关［7］.RSG可恢复内皮素引起SOD活性的降低，保护心肌细胞的损伤也与抗氧化有关.RSG可以降低MDA含量的增加，说明RSG可以抑制内皮素诱导细胞脂质过氧化作用的增强.内皮素导致细胞的损伤是一个复杂的过程.ET1与受体结合后,激活磷脂酶C又水解磷脂酰肌醇生成1,4,5三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油（DAG）.IP3引起肌浆网储存钙的释放，钙离子又通过L型钙通道从细胞外进入细胞内，使得细胞内游离钙增加.胞内钙和DAG可激活PKC,并促进心肌细胞Na+/H+交换，增加胞浆钠浓度，降低H+浓度使胞浆碱化，胞浆Na+浓度升高又可激活Na+/Ca2+交换，促进Ca2+内流引起钙超载［8-10］.王庭槐等［11］发现用PKC激动剂PMA预处理耗竭或减少心肌细胞的PKC，能明显减弱ET1诱导瞬时［Ca2+］i的升高，说明PKC在ET1诱导瞬时相的［Ca2+］i升高中起重要作用.RSG可减弱ET1和PKC激动剂PMA引起的心肌肥大［12］，说明RSG可能部分阻断PKC途径抑制ET1引起的心肌肥大，减少了随后Na+/H+交换和Na+/Ca2+交换的激活，抑制钙的内流，减轻细胞的钙超载.此外RSG是胰岛素的增敏剂，胰岛素对心肌细胞的损伤有保护作用，因此，RSG的效应也可能部分是胰岛素的保护作用［13］.【参考文献】［1］朱肖星，梅其炳，刘莉，等.内皮素１对新生大鼠心肌细胞的影响及机制［J］.心脏杂志，2005，17（5）：441-444.［2］Michael J.Ryan,Sean P.Didion,Satya Mathur et al.PPARγagonist rosiglitazone improves vascular function and lowers blood pressure in hypertensive transgenic mice［J］.Hypertension,2004,43(3):661-666.［3］朱萧玲，熊利泽，陈绍洋，等.川芎嗪对内皮素起心肌肥大的影响［J］.医学研究生学报，2006，19（3）：214-216，220.［4］高鹏，熊利泽，路志红，等.缺血后处理对兔脊髓缺血再灌注损伤中MDA和SOD的影响［J］.第四军医大学学报，2006，27（14）：1273-1275.［5］Endoh M,Fujita S,Yang HT,et al.Endothelin:receptor subtypes,signal transduction,regulation of Ca2+transients and contractility in rabbit ventricular myocardium［J］.Life Sci,1998,62(17):1485-1489.［6］Hong SJ Mechanism of endothelin1induced cytosolic Ca2+mobility in cultured H9c2 myocardiac ventricular cells［J］.Cell Signal,2002,14(10):811-817.［7］Tao L,Liu HR,Gao E,et al.Antioxidative,antinitrative,and vasculoprotective effects of a peroxisome proliferatoractivated receptorγagonist in 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