姜科植物中蛋白遗传多样性的研究分析姜科(Zingiberaceae)是单子叶植物中的一个大科,分为2个亚科4族52属,约1500种,主要分布于热带、亚热带地区[1]。在我国,姜科植物主要分布在西南部和东南部的一些省份,有20属、216种[2,3]。姜科植物拥有较长的药用历史,它的药效通常是解表散寒、理气健胃[4]。其中,包含很多常用药材如益智和砂仁,并以“四大南药”而著称[5]。姜科植物的化学成分中均含有挥发油成分,因此有比较芳香的气味,除此之外还含有黄酮类、甾体皂苷类和双苯庚烷类等[6,7,8]。姜科植物资源丰富,已有基于PCR扩增技术的分子标记如AFLP、ISSR、SRAP、ITS等研究姜科植物资源的遗传多样性[9,10,11,12]。目前关于姜科植物蛋白的遗传多样性研究尚未见报道,蛋白作为基因表达的直接稳定产物且受相关基因的严格调控,同样能在生化水平上反映遗传物质组成上的差异[13]。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)具有变性蛋白质可溶解、泳动速度只与分子量大小相关、与蛋白所带电荷和形态无关等特点[14],成为一种有效工具已经被广泛应用于解决植物分类、进化问题及品种和变种的鉴定等方面[15,16]。笔者通过优化蛋白提取方法,利用SDS-PAGE电泳技术对7种姜科植物的蛋白进行研究分析,获得蛋白的电泳指纹图谱,拟从蛋白水平探讨姜科植物的遗传多样性,旨在为姜科植物资源的分类、进化问题研究及品种鉴定等提供理论依据。1、材料与方法1.1材料1.1.1供试样品。姜科植物样品均采集于中国医学科学院药用植物研究所(海南分所),由郑希龙副研究员负责鉴定(表1)。采集后的叶片加液氮研磨,置于-80℃冰箱保存。1.1.2试验试剂。植物蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;考马斯亮蓝G-250购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。1.1.3试验仪器。PL602-S电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);WD-9405B水平摇床(沃德生物医学仪器公司);Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司);DYY-12型电泳仪(北京市六一仪器厂);HHCP-01型二氧化碳培养箱(上海申贤恒温设备厂)。1.2方法1.2.1三氯乙酸(TCA)/丙酮法。TCA/丙酮法提取蛋白参照文献[17]。称取0.5g姜科植物叶片放入研钵中,迅速加液氮研磨成粉末状,将粉末转入10mL离心管中,加入6mL预冷的10%TCA/丙酮溶液,涡旋混匀,-20℃沉淀若干小时。4℃15000r/min离心20min,取上清液2mL转移至10mL离心管中,加入3倍体积的预冷丙酮,充分混匀。4℃12000r/min离心25min,弃掉上清液后,抽真空挥发丙酮浓缩成干粉,加入100μL的蛋白裂解液,使用超声波仪器使其溶解,得到蛋白液。1.2.2Tris-HCl法。Tris-HCl法提取蛋白参照文献[17]。称取0.5g姜科植物叶片放入研钵中,加入其鲜重10%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末,加入液氮充分研磨成粉末。将粉末转移至10mL离心管中,加入其3倍蛋白提取缓冲液(68mmol/LTris-HClpH6.7,0.6%SDS,10%甘油和3%β-巯基乙醇),振荡器振荡15min后4℃放置1h,充分溶解蛋白。4℃12000r/min离心25min,取上清液2.0mL转移至10mL离心管中,加入6mL预冷的丙酮,充分混匀,放入-20℃冰箱,沉降蛋白2h,12000r/min离心15min。取沉淀蛋白,抽真空挥发丙酮浓缩成干粉,加入300μL电泳上样提取缓冲液(12.5%0.5mol/LTris-HClpH6.8,10%甘油,5%β-巯基乙醇和72.5%的蒸馏水),使用超声波仪器溶解沉淀后,4℃12000r/min离心5min,取上清液备用。1.2.3试剂盒法。称取0.5g的姜科植物叶片,加入其鲜重10%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末,用其3倍蛋白提取缓冲液(45.5μL1mol/LTris-HClpH6.8,5mL10%SDS,10mL甘油,5mLβ-巯基乙醇,84.45mL蒸馏水)研磨粉碎后转移到2.5mL离心管中,加入1mL的蛋白裂解液后振荡混匀放置30min(4℃),且每隔5min左右就振荡一下,4℃12000r/min离心30min,取上清液备用。1.2.4聚丙烯酰胺电泳分析方法。SDS-PAGE采用12%的分离胶和5%的浓缩胶,点样量为10μL。在80V恒压下电泳1h后,调整电压120V,继续电泳3～4h。当指示剂到凝胶底部1.5cm左右停止电泳。电泳结束后,将胶从玻璃板上剥离下来加入考马斯亮蓝染色液染色,再脱色,使胶的蓝色褪去并且有清晰可见的蛋白条带,用自动数码凝胶显像系统将脱色好的胶拍照保存并分析。1.3数据统计根据电泳谱带进行统计时,有带记为1,无带记为0,形成原始数据矩阵。计数多态性带数,计算多态性带数百分率,并使用软件NTSYS基于遗传相似系数对各种姜科植物进行聚类分析。2、结果与分析2.1蛋白提取方法分析分别采用TCA/丙酮法、Tris-HCl法和试剂盒法对益智的总蛋白进行提取,并进行电泳以比较这3种方法的优缺点,结果如图1所示。由图1可见,试剂盒法提取蛋白条带和蛋白浓度的效果均优于TCA/丙酮法和Tris-HCl法;TCA/丙酮法和Tris-HCl法相对于试剂盒法具有耗时久、操作麻烦等缺点;BCA蛋白浓度测定试剂盒测定的蛋白浓度依次为:TCA/丙酮法2.7g/L,Tris-HCl法4.6g/L,试剂盒法8.2g/L。综上所述,选用试剂盒法对所有姜科植物的蛋白进行提取。图13种不同方法提取益智蛋白的电泳图2.2姜科植物的蛋白电泳分析7种姜科植物的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,结果如图2所示。由图2可见,其分子量均分布在66.2～14.4kDa。7种姜科植物中共检测出52个迁移率不同的蛋白条带,其中共有条带为14个,多态性条带38个,平均多态性比率为73.1%(表2)。7种姜科植物的蛋白谱带数因材料而异。其中,爪哇白豆蔻分离出的蛋白谱带数最多,共有11条蛋白条带,分别为6条明带和5条暗带;光叶山姜材料分离出的蛋白谱带数最少,只有5条蛋白谱带且均是暗带;草豆蔻和高良姜的蛋白谱带分布非常相似,主要蛋白谱带均有7条,分别为2条明带和5条暗带;益智和砂仁的蛋白谱带均有8条,其差异是益智在97.4kDa的附近有1条蛋白暗带,砂仁在22.0kDa附近处有1条蛋白暗带。图27种姜科植物的蛋白电泳图2.3聚类分析利用软件NTSYS对7种姜科植物进行聚类分析,结果见图3。由图3可见,其遗传相似系数变异范围在0.50～1.00,以遗传相似系数0.87时,可以分为4类:光叶山姜、阳荷和爪哇白豆蔻各自为一支,草豆蔻、益智、高良姜和海南砂仁则聚为一支。光叶山姜和其他6种姜科植物的遗传相似系数较小,表明亲缘关系较远。益智和砂仁聚在一组,遗传相似系数较大,约为0.90,表明亲缘关系较近。草豆蔻和高良姜聚为一类,遗传相似系数为1.00,表明草豆蔻和高良姜无法区分,其两者蛋白之间差异最小。3、结论与讨论海南岛姜科资源丰富,探究姜科植物资源的蛋白遗传多样性,阐明不同姜科植物种质资源的亲缘关系,可为姜科植物品种鉴定和保护提供理论依据,进而推动姜科资源更深层的开发利用[18]。该研究通过优化蛋白提取方法,采用SDS-PAGE电泳技术对7种不同的姜科植物蛋白遗传多样性进行了初步研究。结果表明,试剂盒法提取的蛋白效果最佳,姜科植物在蛋白水平上具有丰富的遗传多样性,可作为评价姜科植物遗传多样性的生化标记。图37种姜科植物的聚类分析蛋白遗传多样性研究是以SDS-PAGE电泳的蛋白条带数、迁移位置、条带颜色深浅作为评价指标,受到蛋白提取方法的影响比较大[19]。为避免这种误差的影响,该研究以益智为材料进行蛋白提取方法的优化。结果表明,试剂盒法提取的蛋白电泳条带更多且清晰,而TCA/丙酮法和Tris-HCl法提取的蛋白电泳条带少且不清晰。BCA蛋白浓度测定结果表明,蛋白浓度依次从大到小为试剂盒法>Tris-HCl法>TCA/丙酮法。因此,选用试剂盒法提取姜科植物蛋白是比较切实可行的方法。SDS-PAGE电泳结果表明,7种姜科植物的蛋白分子量均分布在66.2～14.4kDa,共检测出52个迁移率不同的蛋白谱带,其中共有条带为14个,多态性条带38个,平均多态性比率为73.1%。从聚类分析结果来看,以遗传相似系数0.87时可将7种姜科植物分为4类:光叶山姜、阳荷和爪哇白豆蔻各自为一支,草豆蔻、益智、高良姜和海南砂仁则聚为一支。光叶山姜和其他6种姜科植物的关系最远,益智和砂仁的关系最相近,而草豆蔻和高良姜则无法区分。草豆蔻、高良姜和益智均属于山姜属植物,亲缘关系较近,虽然光叶山姜也同属山姜属,但其亲缘关系较远,与Kress等[20]对姜科植物的聚类分析结果一致。白豆蔻和砂仁同属豆蔻属,但亲缘关系较远,而海南砂仁与山姜属益智亲缘关系较近,与目前临床上常出现砂仁和益智仁混伪品的现象相符合[21]。因此,笔者通过SDS-PAGE电泳技术对7种姜科植物的多样性进行研究,建立了姜科植物蛋白遗传多样性的研究方法,为其他姜科植物的蛋白遗传多样性研究、图谱鉴定、聚类分析等奠定了基础。参考文献：[1]谢建光,方坚平,刘念.姜科植物的引种[J].热带亚热带植物学报,2000,8(4):282-290.[2]熊秉红,禹玉华,李素文,等.中国姜科野生资源的收集繁育与应用[J].中国野生植物资源,2017,36(5):53-57,74.[3]黄威廉.姜科植物族属分类及地理分布[J].贵州科学,2013,31(3):1-4,16.[4]秦华珍,王晓倩,柳俊辉,等.姜科山姜属中药药理作用的研究进展[J].广西中医药,2010,33(5):1-3.[5]张俊清,段金廒,叶亮,等.益智的历史沿革与应用特点[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(21):289-292.[6]张俊清,王勇,陈峰,等.益智的化学成分与药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发,2013,25(2):280-287.[7]李祖强,罗蕾,马国义,等.姜科植物化学成分的色谱/质谱研究[J].光谱实验室,1997(4):1-5.[8]李丽丽,田文仓,刘茵,等.砂仁中化学成分及其药理作用的研究进展[J].现代生物医学进展,2018,18(22):4390-4396.[9]高炳淼,潘坤,田建平,等.南药益智AFLP-PCR体系的建立与优化[J].生物技术,2015,25(3):251-255.[10]潘坤,高炳淼,王阿超,等.基于ISSR标记的海南高良姜种质资源遗传多样性分析[J].分子植物育种,2016,14(8):2224-2231.[11]郭艺,高炳淼,潘坤,等.基于ITS序列研究南药益智遗传多样性[J].分子植物育种,2018,16(3):1027-1032.[12]欧虹雅,韩冬苗,黄兹宝,等.南药益智SRAP-PCR体系优化及引物筛选[J].生物技术进展,2018,8(4):338-344.[13]吴珊,舒晓霞,马宗祥.紫苏醇溶性种子蛋白遗传多样性分析[J].农业与技术,2017,37(10):24-25.[14]杨欣,王秋红,王悦,等.不同地区板蓝根蛋白SDS-PAGE分析[J].中国中医药信息杂志,2015,27(7):86-88.[15]潘红梅,吴卫,申浩,等.川半夏资源可溶蛋白图谱遗传多样性分析[J].时珍国医国药,2011,22(11):2781-2783.[16]范玮,余伯阳,刘吉华.3种虫类药材蛋白指纹图谱的建立[J].药物生物技术,2014,21(6):511-514.[17]张宇,唐志鹏,秦荣耀,等.4种金柑叶片蛋白质提取方法比较分析[J].西南农业学报,2018,31(10):2047-2051.[18]孔继君,刘刚.姜科植物研究进展[J].西北植物学报,2005,25(8):1692-1699.[19]马林,王普昶,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