氯化两面针碱的研究近况药学论文.doc

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氯化两面针碱的研究近况_药学论文【关键词】两面针；,,氯化两面针碱；,,药理作用摘要：目的了解传统中药两面针的主要有效成分氯化两面针碱的研究进展。方法以国内外相关文献作为基础，综述了氯化两面针碱的理化性质、提取分离、药理作用等方面的研究。结果和结论氯化两面针碱的理化性质清楚，提取、分离、含量测定有多种方法，具有抗肿瘤、强心、降血压、抗真菌等药理作用，其作用机制有待于进一步深入研究，特别是抗肿瘤活性方面具有研究价值和开发利用前景。关键词：两面针；氯化两面针碱；药理作用氯化两面针碱（nitidine chloride）是由芸香科花椒属植物两面针的干燥根中提取的一种生物碱［1］，其原植物两面针Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.主要分布于广东、广西、云南、福建等南方省份，广西资源尤为丰富。两面针性辛、苦、微温，有小毒，归肝、肾经，用于治疗胃痛、牙痛、神经痛、风湿骨痛、毒蛇咬伤等多种病症［2］。现代研究证明两面针具有抗肿瘤、抗炎镇痛等作用。氯化两面针碱是两面针的主要有效成分，是两面针及其制剂的主要质量控制指标成分，近年来研究发现两面针碱的抗肿瘤活性较强，在抗肿瘤治疗方面具有比较广泛的开发利用价值和应用前景。因此，本文对氯化两面针碱的研究现状做一综述。1氯化两面针碱的理化性质氯化两面针碱的分子式为C21H18O4NC・2H2O［3］，结构式见图1，属苯骈菲啶类生物碱，为黄色或淡绿色针状结晶。溶于甲醇、乙醇和水，室温下每毫升水能溶解0.2 mg，熔点275～276℃。图1氯化两面针碱（略）2氯化两面针的提取、分离两面针根和根皮中所含化学成分复杂［1，4，5］主要有苯骈菲啶类生物碱（目前已报道的有30余种，）、黄酮类、木脂素类、香豆精类分、甾醇等，并有Zn、Cu、Fe、Ca、Mn、Mg等微量元素［6］。从两面针根中分离生物碱，氯化两面针碱的得率最高。黄治勋［3］用95%乙醇温萃取，滤液减压回收乙醇得深褐色稠膏。此膏用5%乙酸反复捏溶，减压滤取沉淀，沉淀用95%乙醇洗涤多次，得青黄色沉淀。将此沉淀溶于温水中，氨水碱化，氯仿萃取。回收氯仿，残留物溶于盐酸，放置一昼夜后析出粗结晶。将粗结晶溶于热甲醇，活性炭脱色，水浴回流后趁热过滤，滤液置于60℃保温瓶中结晶，析出黄色针状结晶。滤取结晶，经甲醇重结晶，得氯化两面针碱。用此种方法从两面针根中分得氯化两面针碱的得率为0.149%。王玫馨［7］的提取方法略有不同。用甲醇热回流提取，减压回收为原量的1/4，得膏为黄绿色。用氯仿反复研磨，所得沉淀用甲醇溶解，加盐酸至pH为2，放置后析出淡绿色针状结晶，为氯化两面针碱。用此种方法从广州地区产的两面针根皮中分得含量高达0.2%～0.3%的氯化两面针碱，溶点276～277.5℃，硅胶CMC薄层层析Rf=0.36，绿色荧光，显色后呈棕黄色。所测得的紫外光谱、红外光谱与黄治勋的结果基本一致。核梯共振谱与文献［8］结果一致。雷鹏等［9］采用正交实验法，以氯化两面碱的转移率为指标，对两面针的提取工艺进行优选。发现用水提取两面针，氯化两面针碱的转移率相当低，不到30%，而用乙醇提取，氯化两面针碱的转移率可达70%，故确定提取溶媒用乙醇。选择乙醇浓度、溶媒用量、提取时间3个因素，每个因素设3个水平。正交实验结果表明，最佳提取工艺条件是用60%乙醇溶液提取2次，每1次9倍量，提取2 h；第2次7倍量，提取1.5 h。另外对药材形态也进行了考察，发现用丁状小块药材（约为1 cm3）进行提取效果最好，提取2次，相对转移率可达90%。雷鹏等测得药材中氯化两面针碱的平均含量为0.236%。3氯化两面针碱的含量测定两面针药材中氯化两面针碱的含量测定方法有薄层色谱法、薄层――紫外分光光度法、双波长薄层扫描法、高效液相色谱法等［10］。《中国药典》2000版采用薄层扫描法，薄层条件为含0.5%羧甲基纤维素钠的硅胶G板，以苯醋酸乙酯甲醇异丙醇浓氨水（20∶5∶3∶1∶0.12）为展开剂，预饱和10 min，选择波长300 nm作为测定波长，波长210 nm作为参考波长。样品按干燥品计算，以两面针碱（C21H18NO4）计，含量不得少于0.25%。雷鹏等［9］考察了甲醇液直接超声法、湿浸15 min后超声法、加热回流提取法及索氏提取法等样品处理方法，以索氏提取法所测得两面针药材中氯化两面针碱的含量最高。张守尧等［11］比较了超声30 min，超声60 min，浸泡过夜后超声30 min，60℃热浸30 min超声60 min，索氏提取法等样品处理方法，认为超声热提法较佳。刘鹏翰等［12］采用不同方法处理受试品（妇炎净片），以2%HCl超声30 min―氯仿分层及甲醇索氏提取效果最好，加样回收率分别为100.26%和99.8%。两种处理方法测得的氯化两面针碱的含量结果基本一致，重现性好。欧国灯等［12］对《中国药典》中氯化两面针碱的测定方法进行了改进，预饱和时间改为30 min，展开效果较理想，斑点整齐、集中，呈圆形。上行展开14 cm以上，可使供试品中的其他成分与氯化两面针碱完全分开，有利于仪器扫描。赖茂祥等［14］用TLC―UV法测定氯化两面针碱的含量，薄层条件为含0.7%CMC的硅胶H板，展开剂为氯仿甲醇9∶1，醋酸乙酯95%乙醇3∶1（二次展开），展距10 cm。在（329±1）nm的波长处有较好的特征性吸收。测得广西产两面针根中氯化两面针碱的含量为0.2%，加样回收率为98.7%。张守尧等［11］用高效液相色谱法测定两面针药材中氯化两面针碱的含量，方法灵敏、准确、重现性好。色谱柱为HYPERSILBDS C18（4.6 mm×250 mm,5μm）；流动相：0.02 mol/L的磷酸二氢钾乙腈（70∶30）；流速1 ml/min，检测波长为328 nm，外标法定量。氯化两面针碱在1.024～12.288μg/ml范围内线性关系良好，最低检测下限为0.8μg/ml，测得两面针碱的含量为0.16%。陈钧等［15］用反相高效液相色谱法测定两面针霜剂和药材中氯化两面针碱的含量，认为HPLC测定方法专属性、灵敏度均较高，更适合于中药质量标准的控制。色谱柱为Lichrosorb RpC18(4.6 mm×150 mm,5μm)；流动相：甲醇∶乙腈∶水∶10%三乙胺=82∶6∶12∶1（用磷酸调至pH 7.0）；流速1 ml/min,检测波长为271 nm。此种方法测得两面针根粉末中氯化两面针碱的含量为0.21%～0.26%。另外，张守尧等［16］用高效液相色谱法对两面针不同药用部位的两面针碱含量进行测定比较，发现在两面针的根中两面针碱含量明显高于茎和叶中的含量。在根中，两面针碱含量为0.15%，在茎和叶中分别为0.06%（老茎）、0.007 3%。证明了传统药用部位为根的合理性，同时说明市场上将两面针茎部充作药材是不合理的。4药理作用氯化两面针碱是两面针制剂的主要有效成分，在抗炎、镇痛、抗肿瘤、心血管系统等方面的作用已有较多报道。4.1抗肿瘤氯化两面针碱有较强的抗癌作用，据文献［2］报道，对LEWIS肺癌、人体鼻咽癌、肝癌、慢性粒细胞白血病均有抑制作用，对小鼠艾氏水癌、肝癌腹水也有效。4.1.1樊亦军等［17］用放影方法研究了氯化两面针碱对小鼠艾氏腹水癌细胞生长周期的影响。氯化两面针碱20 mg/kg腹腔注射，癌细胞有丝分裂指数下降，肥大细胞比例增加；在48 h内能明显阻止癌细胞增殖，细胞被阻滞于G2期。剂量为40 mg/kg时，对S期细胞也有一定杀伤作用。4.1.2黄治勋［3］报道氯化两面针碱能延长艾氏腹癌小鼠的生命，剂量按每公斤体重用量（mg/kg）计，抑制率为279%，对小鼠肝癌腹水也有效。临床试用结果表明，氯化两面针碱对慢性粒细胞白血病有近期疗效。4.1.3 Wall ME等［18］报道氯化两面针碱和6-甲氧基-二氢白屈菜红碱（从两面针根中分离的另一种苯骈菲啶类生物碱）对小鼠白血病P388的作用几乎相等。在给予30～50 mg/kg时，小鼠生命延长率达240%～260%。4.1.4 Maurizio Del Poeta等［19］比较了氯化两面针与喜树碱的体外抗癌活性，选择B16（黑色素瘤细胞株）、MCF7、HS578T（乳腺癌细胞株）、DU145、MPC3等癌株（前列腺细胞株）。氯化两面针碱的IC50分别为370.0，40.59，145，2.64，78.89 ng/ml；而喜树碱的IC50分别为8.35，0.69，4.14，3.69，2.54 ng/ml，其他喜树碱衍生物（托泊替康、依立替康等）的IC50也明显低于氯化两面针碱。因此认为对于实体瘤，氯化两面针碱的抗肿瘤活性弱于喜树碱及其衍生物。但B Gatto,Sanders［20］的研究表明，两种对喜树碱耐药的人类细胞CPT-K5HE和A2780/CPT2000（人卵巢癌细胞系）仍对氯化两面针碱有部分敏感性。并认为发展氯化两面针碱成为新的拓朴异构酶Ⅰ抑制剂，以克服癌细胞对喜树碱类药物的抗药性成为可能。4.2抗肿瘤机制研究4.2.1樊亦军［17］以3H胸苷及3H尿苷脉冲标记，以细胞平均颗粒数为指标，观察到氯化两面针碱能抑制DNA合成，而对RNA的抑制作用较弱，认为其抗肿瘤机制可能是抑制DNA合成。VS Sethi［21］的研究结果与之相似，DNA聚合酶和RNA逆转录酶的活性被强烈抑制，然而RNA聚合酶和多聚和多聚腺苷酶的活性只是被轻微影响。并认为氯化两面针碱能干扰模板引物的A∶T碱基对，从而抑制肿瘤病毒的RNA逆转录酶的活性、NIHSwiss小鼠胚胎的DNA多聚腺苷酶性的活性，从而抑制DNA合成。4.2.2 LK Wang等［22］报道两面针碱是具有特征性的拓朴异构酶Ⅰ（topoisomeraseⅠ）的功能抑制剂，与喜树碱相同，可稳定小牛胸腺拓朴异构酶Ⅰ和DNA形成的共价二元复合物，只需0.15～0.30μmol/L就能产生效应。两面针碱可抑制拓朴构酶Ⅰ介质的使DNA质体超螺旋松开的作用，从而阻止DNA复制，且比喜树碱更有效。但与喜树碱不同，两面针碱也能介导B型DNA的解旋并与之直接结合。他也研究了两面针碱与小牛胸腺拓朴异构酶Ⅱ形成的复合物，使DNA质体超螺旋松开的效应。可对拓朴异构酶Ⅱ介导的解旋起到中等强度的抑制作用。但所需浓度为40μmol/L，而拓朴异构酶Ⅱ抑制剂阿霉素达到同样程度的抑制作用只需2.5μmol/L，在10μmol/L就可对拓朴异构酶Ⅱ产生强抑制。B Gatto［20］也认为：两面针碱对拓朴异构酶Ⅰ、拓朴异构酶Ⅱ都有抑制作用，拓朴异构酶Ⅰ是其细胞毒作用的靶点。4.2.3陈元柱等［23～25］认为氯化两面针碱的抗肿瘤机制与其分子的平面性和极性有关。氯化两面针碱具有带正电荷的离子骨架，及活泼的C6=N5双键，它可能是一种抗癌活性基因，推测它在合适的条件下（如pH和温度）能与细胞中的生命物质如丝氨酸、苏氨酸、核酸（均含-OH）以及半胱氨酸（含―SH）等发生加成反应。因为肿瘤细胞带着比正常细胞多一倍的负电荷，带正电荷的氯化两面针碱进入体内后，由于静电引力使它们具有一定亲合力。在pH≈7.4的人体环境中，氯化两面针碱夺取它周围邻近的氧原子变成氧化两面针碱，使肿瘤细胞窒息甚至死亡。生成的氧化两面针碱沉积在肿瘤细胞表面不易清除，阻隔或抑制肿瘤细胞的生成。在肿瘤细胞含氧量不足时，两面针碱可能与其细胞中具有-OH基的氨基酸反应生成二氢化两面针碱也会杀伤肿瘤细胞。但杨洪勤等［26］研究了氯化两面针碱在不含特定氨基酸的碱溶液中的反应，同样获得了氧化两面针碱和二氢化两面化碱。认为氯化两面针碱在不含特定氨基酸的碱溶液中的反应，同样获得了氧化两面针碱和二氢化两面针碱。认为氯化两面针碱可以和含-OH或-SH的生命分子生成加合物的推理似难成立，基本否定了陈元柱等提出的可能的抗癌机制。综上所述，氯化两面针碱的抗癌机制可能是多方面的，既有抑制拓朴异构酶Ⅰ、Ⅱ，阻止DNA复制，产生细胞毒作用；也有对DNA碱基对的嵌入作用，从而阻止DNA合成；还有分子中正电荷与生物大分子上负电荷的静电作用以及可能的化学反应。究竟何种途径更为重要，仍待深入研究。4.3对心血管系统的作用研究表明［27］:氯化两面针碱和6甲氧基5，6氢白屈菜红碱有明显强心作用。氯化两面针碱10、15、20 mg/kg在60 min内给麻醉犬静脉滴注，使心率、心输出量和呼吸频率明显增加，但对血压及肺循环和循环的血管阻力无明显影响。另据文献［2］，氯化两面针碱对家兔有降血压作用。4.4对钙调素的作用杨东丽等［28～29］报道两面针碱可能是钙调素（calmodulin CaM）的拮抗剂，它对CaM依赖的环核苷酸磷酸二酯酶（CaMPDE）的基础活性几乎无影响，而对该酶的CaM激活活性有明显的抑制作用，IC50为86μmol/L。而且两面针碱与三氟啦嗪之间有协同作用，说明两面针碱与三氟啦嗪对CaM的作用位点不同。鉴于肿瘤细胞中的CaM水平增高，CaM拮抗剂有潜在的抗肿瘤作用。这也可能是两面针碱的抗肿瘤机制之一。4.5抗真菌Maurizio Del Poeta等［19］的研究表明，氯化两面针碱具有抗真菌活性。他们比较了氯化两面针碱与喜树碱类药物的体外抗真菌的活性。喜树碱对致病性真菌野生株的MIC＞100μg/ml，对具有△erg6的突变株（此突变株使得药物更容易渗入细胞）的MIC为6.25μg/ml；喜对碱对不表达拓朴异构酶Ⅰ的△erg6△topl的双重突变株MIC＞100μg/ml，而对引入新隐球菌拓朴异构酶Ⅰ质粒的△erg6△topl双重突变株MIC为0.19μg/ml。这表明喜树碱类药物的抗真菌活性由于对细胞渗透性而受到限制，拓朴异构酶Ⅰ是其作用靶点，而且只有在拓朴异构酶Ⅰ存在且大量表达的情况下才能达到杀灭真菌的程度。但是氯化两面针碱对受试的真菌株均表现出抗真菌活性，它对致病性真菌野生株的MIC为6.25μg/ml，对具有△erg6的突变株MIC为1.56μg/ml；对不表达拓朴异构酶Ⅰ的△erg6△topl的双重突变株MIC为3.12μg/ml，而对引入新隐球菌拓朴异构酶Ⅰ质粒的△erg6△topl双重突变株MIC为3.12μg/ml。这表明拓朴异构酶I不是氯化两面针碱抗真菌的唯一靶点，在药物渗入细胞方面也几乎不存在问题，因为它对野生株的MIC与对△erg6突变株的MIC基本一致。与喜树碱类药物相比，氯化两面针碱的抗癌活性稍弱但抗真菌活性较强，有望成为一类新的抗真菌药物。目前需要有更多的实验结果以支持这一结论，氯化两面针碱类药物也需要做进一步的结构修饰，使它的真菌和哺乳动物细胞之间有更好的选择性，以降低它的毒性。此外，两面针中的香叶木苷有明显的抗炎作用［30，31］，木脂类化合物结晶8有解痉、镇痛作用，两面针的乙醇提取物、水提物有抗菌、抗氧化作用等，两面针中提取物S0对小鼠具有显著的镇痛、止血和抗炎作用，两面针还可用于表面麻醉、局部麻醉。以两面针为主药或辅以其他药材制成的制剂很多，本文不再详述。氯化两面针碱来源于植物，可提取分离，能定性定量控制，高效低毒，是一种很有发展前途的抗肿瘤、抗真菌生物活性成分。目前对其药理作用及其机制仍需做更深一步的系统研究，以便为两面针的临床应用和开发提供理论依据，充分发挥两面针的社会效益和经济效益。参考文献：［1］国家中医药管理局.中华本草，上部［M］.上海：上海科技出版社，1999：3821.［2］杨仓良.毒药本草［M］.北京：中国中医药出版社，1993：431.［3］黄治勋，李志和.两面针抗肿瘤有效成分的研究［J］.化学学报，1980，38（6）：535.［4］汤玉妹.两面针化学成分的研究［J］.中草药，1994，25（10）：550.［5］国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册［M］.北京：人民卫生出版社，1986：204.［6］诸葛纯英.常用中药中微量元素的分析［J］.广东微量元素科学，2001，8（7）：59.［7］王玫馨.两面针化学成分的研究Ⅰ：具有抗癌活性生物碱的分离和生物碱丙的结构研究［J］.中山医学院学报，1980，1（4）：342.［8］林启寿.中草药成分化学［M］.北京：科学出版社，1977：759.［9］雷鹏，刘韶，李新中，等.正交实验优选两面针的提取工艺［J］.中医药导报，2005，11（5）：71.［10］国家药典委员会，中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：133.［11］张守尧，王桂芳，邹恒琴，等.HPLC法测定两面针药材中氯化两面针碱的含量［J］.中草药，1998，27（7），445.［12］刘鹏翰，陆来祥，潘声遣，等.HPLC法测定妇炎净片中氯化两面针碱的含量［J］.食品与药品，2005，7（10）：45.［13］欧国灯，陈浩桉.双波长薄层扫描法测定风湿注射液中氯化两面针碱的含量［J］.中药新药与临床药理，2002，13（1）：43.［14］赖茂祥，刘布鸣，蒋瑾华，等.薄层――紫外分光光度法测定两面针中氯化两面针碱的含量［J］.中国中药杂志，1992，17（9）：554.［15］陈均，段更利，黄建明.反相高交流相色谱法测定两面针霜剂和生药两面针中氯华针碱的含量［J］.复旦学报（医学科学版），2001，28（5）：554.［16］张守尧，姚育法，刘楚风.不同部位两面针中氯化两面针药材中氯化两面针碱的含量测定［J］.中药材，2001，24（9）：649.［17］攀亦军，周军.氯化光花椒碱对小鼠艾氏腹水癌细胞生长周期的影响［J］.中国药理学报，1981，2（1）：46.［18］Wall,M.E.,M.C.Wani,and 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