丙肝病毒药物选择压与基因遗传突变.doc

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丙肝病毒药物选择压与基因遗传突变=“news_bd”>丙型肝炎(hepatitis C,HC)是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的感染性疾病，目前每年新发病例约300万，全球感染人数约1.7亿[1]。HCV属于黄病毒科(Flaviviridae)单正链RNA病毒，基因组全长约9.6 kb，编码一条多蛋白前体，随后经过蛋白酶剪切，产生10条多肽蛋白，构成具有不同功能的病毒蛋白。病毒蛋白包括结构蛋白Core、E1、E2、p7及非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B(图1)。其中，结构蛋白参与组成病毒颗粒，而非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B在病毒蛋白成熟及病毒基因组复制过程中发挥关键作用，成为抗病毒治疗的潜在作用靶点[2]。因此，HCV耐药株的突变位点主要位于编码非结构蛋白的基因部位。

HCV有7个基因型和50多个基因亚型。早期治疗HCV使用聚乙二醇化干扰素加利巴韦林标准疗法(standard of care,SOC)。近年来，针对HCV生命周期中特定病毒蛋白的靶向性药物得到了飞速的发展，称为直接作用的抗病毒药物(direct-actingantiviral agents,DAAs)。目前上市及进入后期临床试验的DAA主要分为以下几类：NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS5B RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂(图1)。DAA主要运用于抗HCV的联合疗法中，根据感染病毒的基因型及患者的病情制定8~24周的治疗方案，显著提高了治疗患者的持续病毒应答率(sustained virological response,SVR)。

然而，DAA应用的最大问题是耐药突变株的产生。一些患者在使用DAA治疗后出现病毒反跳现象，正是因为与药物相关的耐药突变体存在导致。HCV很好地诠释了病毒如何通过其本身的快速进化及基因的多样性引起病毒基因组的变化，进而耐受抗病毒药物[3]。由于HCV RNA聚合酶的低保真性，病毒基因组的错配率非常高，加上病毒复制生成的速率较快，导致HCV的基础耐药多态性及用药后短期耐药的产生高于其他病毒[4-5]。许多HCV感染患者接受治疗前，其体内就已经存在大量的HCV准种(quasispecies)。这些准种当中就可能携带针对某一DAA药物的耐药基因[6]。此外，接受治疗的患者体内也可促使病毒进化，衍生出对抗治疗药物的耐药基因[7]。目前，耐药相关的突变体(resistance associated variants,RAVs)既出现在体外实验中，也能在临床试验中观察到[8-9]。本文针对HCV不同基因区域DAA的耐药突变及突变体在不同基因型中的分布，以及对这些耐药突变产生和在临床抗病毒治疗中的影响进行了阐述。

1NS3/4A基因区耐药突变NS3具有丝氨酸蛋白酶活性，在NS4A的辅助下，通过水解多肽链上的蛋白位点，剪切出具有功能的成熟病毒蛋白，后者组成复合体参与病毒基因的复制(图2[10])。蛋白酶抑制剂通过与NS3相互作用，干扰蛋白酶活性，起到抑制病毒复制的作用[11]。代表药物有第一代蛋白酶抑制剂Telaprevir、Boceprevir，第二代蛋白酶抑制剂Simeprevir和Paritaprevir。自2011年第一代蛋白酶抑制剂上市以来，HCV患者的SVR率明显提高。然而，随着时间的推移，包含蛋白酶抑制剂的三联疗法的治疗效果却下降。在治疗失败的病例当中，有71%的患者是由于产生了病毒基因的突变，导致对蛋白酶抑制剂发生了耐药。由于NS3蛋白酶本身的特性，使蛋白酶抑制剂的结合并不紧密。因此，NS3/4A蛋白酶抑制剂的耐药屏障较低，酶上几个关键位点单氨基酸的突变就能导致病毒的抗药性，造成药物敏感性下降(图2)。这些NS3区域氨基酸位点(R155、A156和D168)的突变可以引起针对几乎所有蛋白酶抑制剂耐药及交叉耐药的发生[12-13]。在HCVNS3区域，Q80K变异株在基因1a型的序列中是最常见的一种，发生率高达37.6%，主要与第二代蛋白酶抑制剂Simeprevir的耐药性相关，是导致1a型患者治疗失败的一个常见原因[14]。另一个与Simeprevir的耐药性相关的HCV基因变异株为S122T，在基因1b型中最常出现，发生率为5.5%[14]。在其他基因型的HCV序列中，与Simeprevir相关的位于NS3区域的S122R变异株在基因2型的序列中比较常见，发生率超过45%。此外，与Boceprevir耐药相关的I170V变异株在基因6型序列中也很常见[14]。针对NS3蛋白酶抑制剂的耐药株的发生率最高，而在NS3蛋白酶抑制剂中又以Simeprevir及Boceprevir的发生频次最多。低耐药屏障和交叉耐药的发生是一代蛋白酶抑制剂的关键问题[15]。二代蛋白酶抑制剂，如MK-5172耐药屏障更高、疗效更好[16]。

2NS5A基因区耐药突变NS5A蛋白作为病毒复制复合体中的一部分，在HCV的复制、组装、释放及与宿主细胞相互作用中发挥重要作用[17]。它由三个结构域组成，其中结构域I和II与HCV复制密切相关，而结构域III则在病毒组装过程中必不可少[18](图3[19])。NS5A抑制剂能显著阻断病毒复制及组装，代表药物有Daclatasvir、Ledipasvir和Omitasvir。尽管NS5A抑制剂疗效显著，基因覆盖面广，但它们的耐药屏障较低，并且相关的耐药突变可以在宿主体内维持较长的时间[6]。耐药突变株L31M、P58S和Y93H都位于HCV NS5A基因区域，它们在基因1b型的序列中比较常见(图3)。NS5A抑制剂常会引起HCV基因相关区域M28、E30、L31、P32和Y93的突变，进而导致病毒耐药的发生[20-21](图3)。与Daclatasvir相关的位于NS5A区域的H58P变异株在基因2型的序列中比较常见，发生率超过45%[14]。而在基因3型的序列中，针对Daclatasvir和Ledipasvir的变异株Q30A发生率较高[22]。Q30R变异株可以抵抗现有的三种NS5A抑制剂，主要在基因4型和6型序列中多见。此外，与目前至少两种NS5A抑制剂相关的变异株M28V及Y93S在基因6型序列中也很常见。然而，天然存在的抵抗NS5A抑制剂的病毒耐药株仅在1b型和4型患者中多见。NS5A抑制剂的耐药株的发生率仅次于NS3蛋白酶抑制剂，其中以Daclatasvir的耐药株的发生率居于首位。

3NS5B基因区耐药突变NS5B区编码的RNA依赖的RNA聚合酶，是HCV复制过程中的关键酶[23](图4[24])。NS5B抑制剂主要分为核苷类抑制剂和非核苷类抑制剂。核苷类抑制剂通过与酶的催化位点结合，竞争性抑制HCV RNA的合成，代表药物是Sofosbuvir。非核苷类抑制剂与酶的异构位点结合，通过破坏酶的构象变化抑制酶的活性，代表药物是Dasabuvir。由于NS5B的结构是高度保守的，NS5B抑制剂在各个基因型的HCV患者中都十分有效[25]。NS5B核苷类似物Sofosbuvir的耐药屏障比NS3/4A蛋白酶抑制剂和NS5A抑制剂都要高，因为它模拟的聚合酶底物结合酶的活性部位是酶高度保守的区域。而非核苷类似物抑制剂的耐药屏障在所有DAA中是最低的，它们常用于与其他DAA的联合运用的研究中[26]。NS5B区域的耐药株主要包括针对Sofosbuvir的L159F和针对Dasabuvir的S556G(图4)，它们在基因1b型中较为常见[27]。Sofosbuvir的耐药性相关突变还包括L320F、T179A、S282T/G/C/R、M289L、I293L、C316N、V321A及I434M[28-30](图4)。其中S282T最初是从患者体内发现的，在接受了含有Sofosbuvir的不同抗HCV疗法后，少数治疗失败患者的体内可以检测到S282T的表达[31]。尽管体外实验显示，S287T可从各种基因型的病毒中筛选出来，但这个耐药突变仅在1a和1b型HCV感染中显示出对Sofosbuvir的抵抗性[26,28]。而C316Y和Y448C/H是Dasabuvir相关的最常见的耐药突变株，主要拮抗非核苷类似物在NS5B蛋白三区与四区的结合[32]。总的来说，针对NS3蛋白酶抑制剂的耐药株的发生率最高，其次是NS5A抑制剂。而在NS3蛋白酶抑制剂中又以Simeprevir及Boceprevir的发生频次最高。在NS5A抑制剂中，Daclatasvir的耐药株的发生率居于首位。值得注意的是，针对NS5B核苷类抑制剂Sofosbuvir和非核苷类抑制剂Dasabuvir的耐药株非常少见。此外，发生在同一序列上的多个变异株同时存在的现象也比较少见，唯一例外的就是NS3和NS5A区域多个变异株共存的现象，发生率约为15.6%。

4不同基因型间的DAA耐药突变临床试验的结果显示，DAA的治疗效果在基因1b型中比基因1a型中更佳。相应地，基因1b型的病毒对蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂及非核苷类似物抑制剂的耐药屏障也比基因1a型高。基因1a型的变异株发生率为56%，其中最常见的是针对Simeprevir的位于NS3区域的变异株，如Q80K。基因1b型的变异株发生率为34.3%，变异株主要位于NS5A的区域，发生的变异主要与Daclatasvir耐药相关。基因1a、1b型中与NS5B相关的基因变异株非常少见。基因2型序列中变异株主要位于NS3区域，并多针对Simeprevir。基因3、4型的序列的变异株则多位于NS5A区域。基因6型的序列变异株也主要发生在NS3区域，并多针对Boceprevir和Simeprevir。NS5B区域的针对核苷类似物Sofosbuvir的变异株在基因2型和6型中较为常见，在其他基因型中则比较少见。

5病毒自身的耐药相关基因及药物筛选的耐药突变株针对DAA的耐药基因通常发生在抑制剂靶向蛋白的编码区域的基因，并常引起一个或几个氨基酸位点的改变[33]。根据耐药基因产生的方式，可以分为由于病毒基因天然多态性引起的DAA耐药(主要影响初治患者的治疗效果)，及在药物选择压下筛选出的耐药突变(可能影响治疗失败或复发患者将来的治疗效果)[34]。在一个患者体内，HCV可存在一系列的遗传变异株，这是由HCV聚合酶的低保真性引起的，平均HCV复制一次便能产生一个突变基因[35]。天然存在的耐药突变正是基于HCV的高基础变异率的特性。目前，权威HCV治疗指南中仅推荐在初治患者中检测位于NS3/4A基因位置的Q80K突变，因为这个天然存在的变异株在1a型患者中十分常见[36]。这类患者在接受Simeprevir基础上的三联疗法后，SVR率很低，难以达到原先的治疗效果[37-38]。此外，体外研究发现，大部分的蛋白酶抑制剂对基因3型病毒的疗效欠佳。这主要是由于3型蛋白酶序列上的多态性耐药基因突变D168Q的存在。临床用药导致的耐药突变主要通过HCV的记忆基因组发挥作用，这个功能即使在病毒缺乏宿主的情况下仍旧保留[39]。这种记忆功能是HCV准种的一种复杂的适应性系统。在使用抗HCV药物的情况下，当病毒的一个天然存在的抗药突变体从一系列的HCV基因组群中被筛选出来后，它在整体基因群组中的表达就会明显上升。当选择性压力消失(停止使用药物)，筛选出的耐药株尽管表达会有所下降，但由于病毒的记忆功能，它的水平仍旧高于最初筛选前的水平，导致治疗失败[40]。而携带这个耐药株的患者将来再次接受治疗的疗效也会受其影响。DAA药物相关的耐药突变在亚洲与非洲的发生率最高，而临床使用DAA导致的耐药变异株则在美洲最为常见，可能与美洲广泛使用DAA相关。临床用药相关的耐药株主要也发生在NS3区域，并且大多与Simeprevir耐药相关。近期，多个研究机构推荐使用非干扰素HCV治疗方案以规避干扰素带来的不良反应及低耐受性。在推荐的非干扰素的治疗方案中，发生在HCVNS3及NS5A区域的耐药相关变异株最为常见，但NS5B区域很少产生耐药突变。然而，由于研究的人群太小，对非干扰素DAA疗法相关可能存在的耐药突变及对药物作用的影响程度仍旧需要进一步的探索。此外，对现存的某些耐药基因的检测也能帮助优化最佳治疗方案。

6小结与展望DAA的快速发展使HCV的治疗效果达到了前所未有的高度。然而，HCV能够在药物选择压下迅速进化，利用病毒自身的耐药相关基因的多态性与遗传突变，干扰药物靶向病毒蛋白的过程，极大限制了DAA的使用效果，并常导致治疗的失败。因此，需要对HCV的各种基因准种，尤其是耐药基因的表达进行监控，做好面临不同干预下导致新发或再发感染的可能。同时，开发靶向病毒感染不同阶段如入侵过程的多种类型病毒抑制剂，争取提高抗病毒疗法的耐药屏障。

早期NS3抑制剂单独疗法的运用曾导致严重的药物相关变异株的发生[41]。因此，通过联合不同作用靶点的抗HCV药物，将降低耐药相关变异体的发生。因此，基于核苷类聚合酶抑制剂的非干扰素联合疗法耐药发生率低，成为目前临床抗HCV治疗的首选。此外，针对HCV生命周期不同阶段靶向药物的联合运用能有效提高抗病毒疗法的耐药屏障[42]。本研究组通过筛选天然化合物单体库，发现了具有抑制HCV入侵活性的系列化合物，它们的作用方式各不相同。其中来源于五味子的甘五酸能抑制病毒与宿主细胞膜融合的过程，提取自络石藤的络石藤苷元通过干扰病毒E2蛋白与入侵受体CD81的相互作用阻断病毒入侵[43]。这些化合物靶点各不相同，都干扰了病毒入侵的关键步骤，与目前临床上抗病毒药物联合运用具有协同抑制各基因型病毒感染的效果，是未来抗HCV治疗的研究方向。