小建中汤有无饴糖对实验性脾虚证小鼠血管活性肠肽的影响临床医学论文.doc

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小建中汤有无饴糖对实验性脾虚证小鼠血管活性肠肽的影响_临床医学论文【摘要】目的研究小建中汤有无饴糖对实验性脾虚证小鼠血管活性肠肽的影响。方法以脾虚证小鼠为实验对象，运用放免法测定血浆血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)含量，免疫组化法分析空肠VIP的表达。结果小建中汤有无饴糖均能显著降低血浆中VIP含量，减少空肠VIP表达。结论小建中汤有无饴糖均能显著降低VIP，为小建中汤配伍规律研究提供实验基础。【关键词】小建中汤；脾虚证；血管活性肠肽脾虚证本质的现代研究至今已有二十多年的历史，其中胃肠激素与胃肠运动关系的研究一直是中西医结合研究消化系统及脾虚症、脾主运化本质的一个热点［1］。VIP是肠神经系统中具有代表性的神经肽［2］，由胃肠道粘膜上的D1细胞所分泌，对胃肠运动有重要的调节作用［3］。本实验以苦寒泻下药番泻叶复制脾虚证的实验动物模型为研究对象，观察小建中汤方中有无饴糖对实验性小鼠脾虚证的胃肠动力及血管活性肠肽的影响，为小建中汤的临床应用及配伍规律研究提供药理学实验基础。1材料1.1药物制备小建中汤：由饴糖、桂枝、芍药、甘草、生姜、大枣6味中药组成。以上中药均购自贵阳市阜康堂药店（除饴糖外）。除饴糖外，其余5味先用常水浸泡30 min后加水煎煮2次，每次以武火煮沸15 min，再以文火煎煮30 min；煎液过滤，合并滤液；取1/2滤液按处方量加入饴糖，另1/2滤液不加饴糖，将两滤液于60℃水浴减压浓缩成100%浓度(1 g生药/ml)的药液，即得实验用原方小建中汤(XJZT)、无糖小建中汤(XJZTW)，4℃保存备用。处方中药物比例严格按照张仲景《伤寒论》与统编教材方剂学的药物剂量与比例要求［4］。番泻叶水浸剂：番泻叶购自贵阳市阜康堂药店。将番泻叶投入沸水浸泡［5］，自然冷却后过滤，收集滤液于60℃水浴减压浓缩成100%浓度(1 g生药/ml)的药液，4℃保存备用。所有药材经贵阳医学院生药学与药用植物学教研室龙庆德老师鉴定，均符合《中国药典》2005版要求。补中益气丸(Buzhong Yiqi Pill，BYP)，襄樊隆中药业有限公司，批号：050102。实验时用蒸馏水配成所需浓度。1.2动物清洁级KM小鼠，雌雄兼用，（20±2）g，由贵阳医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(黔)2002-0001。1.3试剂兔抗血管活性肠肽抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，即用型SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，VIP放射免疫测定试剂盒(尚柏生物医学技术有限公司)，Biomias99图象分析系统(四川大学图像图形研究所)。2方法2.1实验性小鼠脾虚证模型的复制、分组及给药［6］取清洁级KM小鼠70只，雌雄各半，体质量（20±2）g，按体质量随机分为7组（每组10只）：正常对照组（等容积蒸馏水）、模型组(等容积蒸馏水)、BYP组（2 g/kg）、XJZT高剂量组（48 g/kg）、XJZT低剂量组（12 g/kg）、XJZTW高剂量组（28 g/kg）、XJZTW低剂量组（7g/kg）。除对照组ig给予等容积蒸馏水外，其余组动物均ig给予番泻叶水浸剂0.5 ml/只，1次/d，连续7 d以复制脾虚证模型。实验第8天，动物均ig给予相应药物，1次/d，连续7 d。其间密切观察小鼠的外观体征（精神活动状况、皮毛色泽等）及饮食、饮水、大小便，并每日称量体质量。2.2小建中汤有无饴糖对脾虚证小鼠血浆VIP含量的影响末次给药后，小鼠眼球取血0.2 ml，加10％EDTA-Na2 30μl、抑肽酶40μl混匀，2 000 r/min离心10 min，取上清液于-40℃保存，按试剂盒说明用放免法检测VIP含量。2.3小建中汤有无饴糖对脾虚证小鼠空肠VIP表达的影响末次给药小鼠脱颈椎处死后，取空肠组织，10%福尔马林固定，常规脱水，包埋，切片，采用即用型二步法VIP试剂盒，检测空肠组织VIP表达的变化。用Biomias99图像分析系统观察VIP免疫反应阳性产物的分布情况，并测量平均灰度(平均灰度值与切片阳性表达强弱成反比，即平均灰度值越小，切片阳性表达越强，表明VIP含量越多；反之，平均灰度值越大，切片阳性表达越弱，则VIP含量越少)。2.4数据分析与处理数据以±s表示，所有资料采用Student-t检验处理。3结果3.1小建中汤有无饴糖对脾虚证小鼠血浆VIP含量的影响番泻叶灌胃给予小鼠复制实验性脾虚证动物模型，小鼠血浆中VIP含量显著增加，连续灌胃给予XJZT和XJZTW 7 d，XJZT和ZJZTW均可以显著降低血浆中VIP的含量，而且XJZT与XJZTW高、低剂量组间未见显著性差异。结果见表1。表1小建中汤有无饴糖对实验性脾虚证小鼠血浆VIP含量的影响（略）3.2小建中汤有无饴糖对脾虚证小鼠空肠VIP表达的影响免疫组化染色显示，模型组VIP阳性产物呈棕黄色颗粒，主要分布在空肠粘膜腺上皮细胞的胞浆内；应用小建中汤加减饴糖方后，空肠粘膜腺上皮细胞胞浆内VIP阳性产物明显减少，表现在平均灰度值增加。XJZT高、低剂量组及XJZT高、低剂量组均可显著降低实验性脾虚证小鼠空肠VIP蛋白的表达，与模型组比较，差异显著。XJZT高、低剂量组与XJZTW高、低剂量组比较，未见明显差异，提示小建中汤加减饴糖方对实验性脾虚证小鼠空肠VIP蛋白表达的影响无明显差异。结果见表2和图1。表2小建中汤有无饴糖对实验性脾虚证小鼠空肠组织VIP蛋白表达的影响（略）4讨论中医认为，脾胃为气血生化之源，后天之本。脾胃具有受纳水谷，并把水谷化为精微，将精微物质吸收运输至全身的生理功能［7］。脾胃虚弱，则受纳运输水谷失职，导致机体胃脘胀痛，腹痛，腹胀等病症。小建中汤是健脾益气的著名古方，原方来源于汉代张仲景的《伤寒杂病论》，其功能“温中补虚，缓急止痛”，临床主要用于治疗脾胃虚寒引起的胃脘痛、腹痛、泄泻、呕吐、反胃、便血、水肿、痰饮等病证。“脾胃虚寒证”是指中焦阳虚,纳运无权而出现的证候。本证多因过食生冷或投药过寒，损伤中阳，以及久病失养或命门火衰，中土失于温煦所致。中焦虚寒，治宜温阳益气，暖胃散寒。《素问·脏气时论》：“脾欲缓，急食甘以缓之”立论，既能温中，又能祛寒，当投以小建中汤［8］。本实验发现给脾虚小鼠灌服小建中汤加减饴糖方后，小鼠的胃肠动力有明显改善，其作用可能与降低血浆及空肠组织的VIP含量有关。VIP是调节消化系统功能的重要胃肠激素之一，主要分布在胃肠神经系统的粘膜下神经丛和肌间神经丛的神经元和神经纤维中，通过旁分泌形式作用于靶细胞，而不是以循环激素的方式对消化道运动起抑制性调节作用［9］。VIP作用于胃肠平滑肌细胞表面的特异性受体，通过结合Gs蛋白激活腺苷酸环化酶(AC)，使细胞内cAMP含量增加，从而活化cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)，引起平滑肌细胞超极化，Ca2+内流减少，从而导致平滑肌舒张［10］。脾虚患者血浆及肠组织VIP水平升高，其水平在一定程度上可反映胃肠道的运动状态。VIP的代谢异常可能是脾虚“运化失常、运化无权”从而产生纳呆、腹胀等症状的因素之一。胃肠上皮细胞基底膜的VIP受体［11］与VIP结合，激活细胞中的CA-P，促进肠上皮细胞分泌电解质和水分，从而导致腹泻［12］。VIP的水平异常可能是脾虚证小鼠在出现腹胀、胃肠蠕动减弱的同时又出现腹泻、便溏甚至脱肛的病理基础。本实验采用小建中汤加减饴糖方治疗脾虚证小鼠，通过降低血浆、空肠组织的VIP含量，调节小鼠的胃肠道运动，使小鼠的腹胀、胃肠蠕动减弱、腹泻、便溏甚至脱肛等脾虚症状得以改善。实验结果提示小建中汤有无饴糖对VIP未见显著影响，为其临床应用及配伍规律研究提供实验基础。【参考文献】［1］刘峰,高士杰,胡慧刚，等.大黄治疗休克后胃肠功能障碍的临床研究［J］.中国急救医学,2003,23(1):38.［2］Yamamoto H,Kuwahara A,Fujimura M,et al.Motor activity of vascularly perfused rat duodenum［J］.Neurogast roenterol Motil,1999,11:232.［3］Vittoria A，Costagliola A，Carrese E，et al.Nitric oxide-containing neurons in the bovine gut,with special reference to their relationship with VIP and galanin［J］.Arch Histol Cytol,2000,63(4):357.［4］许济群.方剂学［M］.上海:上海科学技术出版社,1994:80.［5］刘汶，张敦义.番泻叶致脾虚证动物模型的造型方法［J］.中国中西医结合脾胃杂志,1998,6(4):231.［6］陶玲,史琴,沈祥春.小建中汤有无饴糖对实验性小鼠脾虚模型的作用研究［J］.中药药理与临床,2008,24(6):12.［7］贾守宁.蕨麻对脾气虚小鼠防治作用的实验研究［J］.中成药,2006,28(7):1044.［8］李智申,王立红.小建中汤制方本义浅探［J］.河北中医药学报，1997,12(4):34.［9］Amato A,Baldassano S,Serio R,et al.Glucagon-like peptide-2 relaxes mouse stomach through vasoactive intestinal peptide release［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2009,296(3):G678.［10］Shi XZ,Choudhury BK,Pasricha PJ,et al.A novel role of VIP in colonic motility function:induction of excitation-transcription coupling in smooth muscle cells［J］.Gastroenterology，2007,132(4):1388.［11］Thompson WG,Irvine EJ,Pare P,et al.Functional gastrointestinal disorders in Canada:first population-based survey using RomeⅡcriteria with suggestions for improving the questionnaire［J］.Dig Dis Sci,2002,47:225.［12］谢建群,陆雄,龚丽萍，等.健脾温中法对脾胃虚寒型肠易激综合征模型大鼠血管活性肠肽影响的实验研究［J］.上海中医药大学学报，2003,17(4):49.