谈青光安颗粒剂有效组分对兔眼滤过术后滤过道瘢痕组织TGF-β1和Smad3表达的应用.doc

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谈青光安颗粒剂有效组分对兔眼滤过术后滤过道瘢痕组织TGF-β1和Smad3表达的应用=“news_bd”>青光眼是一种致盲率高、治疗比较困难的眼科常见病。青光眼的治疗以降眼压为根本，手术是目前治疗用药物不能控制眼压的青光眼的重要手段。自青光眼手术开展以来，滤过性手术一直是最主要手术方式。滤过性手术的方法虽然经过了多次改良，但其术后2年内失败率仍然高达15%-30%而难治性青光眼手术治疗的成功率更低，一般只有11%-52%。

青光安颗粒剂已在临床应用于青光眼滤过术后治疗18年，前期实验和临床研究表明，青光安颗粒剂口服能够有效稳定术后眼压，维持功能滤过泡的形态，减少手术区结膜下瘢痕面积，抑制成纤维细胞增殖。但青光安颗粒剂是中药复方药物，其疗效的物质基础还不清楚。本课题组前期研究已建立抗滤过道瘢痕化的高通量筛选体系，针对已有相当研究基础的青光安颗粒剂，进行抗滤过道瘢痕化的中药有效组分高通量筛选，寻找出了4种抗滤过道瘢痕化的有效组分。为找出最优的一种组分，本课题组通过动物实验探讨青光安颗粒剂有效组分抗青光眼术后滤过道瘢痕化的效果及作用机制。

材料1.动物选取健康成年新西兰长耳白兔42只，远交系，SPF级，雌雄不拘，体质量1.8-2.2kg，购自湖南中医药大学动物实验中心，实验前排除全身性病变，双眼部情况检查均正常。

2.药物青光安颗粒剂最优有效化学组分(共4种)，由湖南中医药大学药学院中药化学教研室提供。丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)：浙江海正药业股份有限公司提供;庆大霉素：河南辅仁药业集团有限公司提供;地塞米松：郑州卓峰制药有限公司提供;氧氟沙星滴眼液：湖北远大天天明制药有限公司提供。

3.主要试剂和仪器Triozl(美国Invitrogen公司)，RIPA裂解液，PMSF，Western一抗，二抗稀释液，转膜液(上海碧云天生物技术研究所)，DNA热循环扩增仪(美国Thermo公司)，眼科手术显微镜(德国蔡司公司)，电泳槽和电泳仪(北京六一厂)，凝胶成像系统(美国伯乐公司)。

方法1.青光眼滤过手术动物模型建立水合氯醛配制成浓度100g/L的溶液，按3-4mL/kg耳缘静脉注射麻醉，压陷式眼压计测基础眼压并记录。0.9%氯化钠溶液冲洗结膜囊，在手术显微镜下行左眼小梁切除联合虹膜根部切除术：简易开睑器开眼睑，缝上直肌牵引线，上方角膜缘剪开球结膜和球筋膜约3个钟点范围，做以穹隆部为基底的结膜瓣，暴露准备做巩膜瓣的区域;沿测量标记做以角膜缘为基底的四边形巩膜瓣，大小约3mm×4mm，深度为1/2巩膜厚度，小心向前分离至清亮角膜内至少0.5mm处，做1mm×2mm大小的小梁组织切除并做虹膜根部切除;将巩膜瓣复位对合后，于其两游离角用10/0尼龙线缝合，缝1针，做不可调节缝线;于结膜切口的两端角巩膜缘处各1针缝合结膜切口。手术完成后均于非手术区球结膜下注射庆大霉素加地塞米松0.5mL1次，滴氧氟沙星滴眼液抗感染1周。

2.分组及给药方法采用随机数字法分为7组，每组6只。分别为：正常组，模型组，MMC组，有效组分1、2、3、4组。除正常组外，其余6组实验动物兔眼行常规小梁切除联合虹膜根部切除术。正常组和模型组：于术后第2天开始给药，以0.9%氯化钠溶液5mL/kg灌胃，每日1次，持续4周;MMC组：参照目前MMC与滤过手术联合使用的常用方法，采用术中给药，即在做巩膜瓣之前，用1块大小4mm×4mm含MMC的棉片(MMC浓度0.2mg/mL)放入手术区结膜瓣下巩膜上，放置2min后取出，立即用100mL 0.9%氯化钠溶液充分冲洗干净术区，再完成之后的手术操作。于术后第2天开始以0.9%氯化钠溶液5mL/kg灌胃，每日1次，持续4周;有效组分1-4组：各组于术后第2天开始给药，以相应的有效组分灌胃，例如有效组分1组以青光安有效组分1灌胃，按照成人体表面积法(人体质量按60kg计)计算需要灌胃的药物剂量，再按药物组份提取收集率[4]，算得兔用药剂量，溶于0.9%氯化钠溶液中，以5mL/kg灌胃，每日1次，持续4周。

3.取材术后常规饲养条件饲养4周，空气注射处死动物。用缝线标明眼球水平位及在颞上方标明滤过泡位置后，保留滤过泡，先摘除右眼球后摘除左眼球。右眼经6点-滤过口连线分为内外两部分，液氮保存，一部分供Western blot使用，另一部分供RTPCR使用。

4.检测指标及检测方法4.1 Western blot检测各组滤过泡区域内Tenon囊组织中TGF-β1、Smad3的表达粉碎组织块，加入RIPA缓冲液(每克组织3mL RIPA)，PMSF(每克组织30μL，10mg/mL PMSF)，利用Polytron进一步匀浆维持4℃，加入PMSF(每克组织30μL，10mg/m L PMSF)，冰上孵育3 0 m i n，移入离心管4℃约2 0 0 0 0 g离心1 5 m i n，上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存，取相同质量的细胞裂解液(体积×蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液，__沸水浴中3min，上样，电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA)，电转膜仪转膜(100mA 40min)，显色分析比较记录。

4.2 RT-PCR检测各组滤过泡区域内Tenon囊组织中TGF-β1 m RNA、Smad3 m RNA的表达组织中总RNA的提后进行RNA的鉴定，然后开始RT-PCR扩增，β-actin(450bp)：上游引物序列：5’-CTA CAATGA GCT GCG TGT GG-3’下游引物序列：5’-TAGCTC TTC TCC AGG GAG GA-3’;TGF-β1(271bp)：上游引物序列：5’-CGG CAG CTG TAC ATT GACTT-3’，下游引物序列：5’-AGC GCA CGA TCA TGTTGG AC-3’;Smad3(419bp)：上游引物序列：5’ACCACG CAG AAC GTG AAC AC-3’，下游引物序列：5’-GCT GGT TTT CCT TGG GTA CC-3’。扩增条件：50℃，30min;94℃预变性2min。变性94℃30s，复性58℃30s。及延伸72℃1min，共进行30个循环。取6µL扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，恒压80v，电泳1h，紫外灯下分析PCR结果，并用凝胶成像分析系统测定灰度值，计算SOSC3/β-actin的比值，以获得目的片段的相对表达量。

5.统计学方法所有实验数据采用SPSS 19.0统计学软件处理。计量资料以x-±s表示，先进行正态性分布及方差齐性检验，若满足正态性和方差齐性，多组比较采用方差分析;不满足正态性和方差齐性时，则用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果1.Western blot法检测滤泡区组织TGF-β1和Smad3蛋白表达。Western blot结果显示，在正常组中TGF-β1和Smad3蛋白表达也有较低水平，而模型组中TGF-β1和Smad3表达则显著增加，两组比较，具有显著性差异(P<0.05);与模型组比较，有效组分1-4组和MMC组TGF-β1和Smad3蛋白表达明显降低(P<0.05);与MMC组比较，有效组分2组TGF-β1和Smad3蛋白表达比较差异无显著性意义，其余3组与MMC组TGF-β1和Smad3蛋白表达比较，差异有显著性(P<0.05)，抑制效果不如MMC组。

2.RT-PCR检测各组TGF-β1和Smad3 mRNA的表达与正常组比较，模型组组织中TGF-β1、与Smad3的mRNA表达明显增加(P<0.05)，与模型组比较，有效组分1-4组和MMC组TGF-β1与Smad3的mRNA表达则明显降低(P<0.05);有效组分2组与MMC组TGF-β1和Smad3 mRNA表达比较无统计学意义，其余3组与MMC组TGF-β1和Smad3mRNA表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)，抑制效果不如MMC组。

讨论TGF-β是公认的诱导成纤维细胞胶原合成、促进瘢痕增生的主要细胞因子。Cordeiro M F等通过体外试验证实由基因重组构建的人类的TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3均可刺激成纤维细胞介导的胶原增生，其作用呈浓度依赖性。Smads通路是TGF-β1信号转导中最重要的通路，Smad2/Smad3是TGF-β1信号下传的第一个信号分子。进一步研究表明，由于Smad2比Smad3多了2个氨基酸片段，使得Smad3可直接和DNA结合而Smad2不能，因此，Smad3在TGF-β诱导成纤维细胞胶原合成、促进瘢痕增生的信号转导中起重要作用。进一步研究表明，T GF-β主要通过激活成纤维细胞内Smad3启动胶原基因转录和表达，促进胶原合成。Smad3实质上相当于TGF-β上调成纤维细胞α2Ⅰ型前胶原(type1 A2 procollagen，COL1A2)基因转录的转录因子，而COL1A2基因启动子内的COL1A2基序，即CAGACA序列为其顺式作用元件。TGF-β作用于细胞膜受体后激活胞浆中的Smad3蛋白，后者在核转运载体的协助下发生核聚集，并与转录活化因子结合，识别COL1A2基序，启动α2Ⅰ型前胶原基因的转录。由此可见，瘢痕主要由Ⅰ型胶原大量沉积为主，Ⅰ型胶原主要由α2(Ⅰ)肽链构成，α2(Ⅰ)肽链其前体即为COL1A2，而TGF-β/Smad3信号通路负责调控成纤维细胞COL1A2基因转录，所以TGF-β/Smad3信号通路为瘢痕增生的关键通路。由于TGF-β是促进瘢痕增生的主要细胞因子，凡是能够阻断TGF-β信号传递的物质均可能成为抗瘢痕增生的药物。

青光安颗粒剂是根据青光眼术后的气阴两虚、血瘀水停的病理特点，以益气养阴、活血利水为治疗原则，选用黄芪、生地黄益气养阴，地龙、红花、赤芍通络活血，茯苓、白术、车前子利水祛湿，所制成的治疗青光眼术后的复方制剂。青光安颗粒剂前期动物实验研究表明，该药具有保护和改善急性高眼压后大鼠视网膜细胞色素氧化酶活性节细胞的作用;用于慢性高眼压兔眼滤过性手术后模型上，发现青光安颗粒剂能明显减少术后结膜下瘢痕的形成，维持滤过泡的基本形态和滤过功能，预防术后眼压异常回升，减少眼压对视神经的压迫损害，明显地提高青光眼术后视力和视野的恢复。本课题组前期研究实验已经将抗滤过道瘢痕化的高通量药物筛选体系应用于青光安颗粒剂，从青光安颗粒剂中分离出了50余种组分，建立了青光安中药组份库，然后采用24孔培养板进行Tenon囊成纤维细胞培养，应用倒置荧光显微镜并流式细胞仪检测方法，观察各个组分对体外培养的成纤维细胞中TGF-β1表达的影响，进行反复筛选后，最终筛选了结果最优的4种青光安颗粒剂有效组分，证实了该4种组分能有效地抑制离体培养的成纤维细胞的增殖。本实验通过成功建立滤过手术动物模型，将4种组分应用于术后动物模型上，并通过与正常组、模型组、MMC组比较，实验结果显示，与模型组比较，TGF-β1和Smad3 mRNA及其蛋白表达在正常组中明显低下(P<0.05)，有效组分1-4组TGF-β1和Smad3 mRNA及其蛋白表达均减少(P<0.05)，而有效组分2组与MMC组比较差异无统计学意义，说明有效组份均能够抑制TGF-β1和Smad3 mRNA及其蛋白表达，从而阻断成纤维细胞COL1A2基因转录，减少胶原纤维合成，达到抗瘢痕化的效应。