不同亚型猪流感病毒HA1重组蛋白的制备及H5亚型猪流感抗体ELISA检动物医学论文.doc

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不同亚型猪流感病毒HA1重组蛋白的制备及H5亚型猪流感抗体ELISA检_动物医学论文【中文摘要】将H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型猪流感病毒(SIV)接种9-11日龄SPF鸡胚,收集24h-96h死亡鸡胚的尿囊液,测定病毒血凝效价;经2%甲醛37℃灭活48h并浓缩,制备了猪流感免疫抗原;选取无SIV感染的健康猪进行免疫,分别制备了抗H1、H3、H5和H9亚型SIV阳性血清250-300ml,HI效价达1/640。根据H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型SIV的HA基因序列设计特异性引物,以RT-PCR从病毒尿囊液中扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型SIV浙江株HA1基因,分别克隆到pET-28a(+)和pET32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-HA1/H1、pET28a-HA1/H3、pET32a-HA1/H3、pET28a-HA1/H5、pET32a-HA1/H9;将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,pET28a-HA1/H1、pET28a-HA1/H3、pET32a-HA1/H3、pET28a-HA1/H5、pET32a-HA1/H9,在大肠杆菌中成功表达His-HA1/H1(45kDa)、His-HA1/H3(45kDa)、Trx-His-HA1/H3(58 kDa)、His-HA1/H5(45kDa)和Trx-His-HA1/H9(56kDa)融合蛋白,表达蛋白均可被抗His单克隆抗体和相应亚型猪流感阳性血清特异识别,表明融合蛋白具有良好的免疫学活性。诱导表达条件优化结果表明,诱导菌体OD_(600)=0.3-1.0、0.1mM IPTG、37℃诱导4h为最佳表达条件;可溶性分析显示表达蛋白主要以不溶性包涵体形式存在。采用咪唑竞争结合法在变性条件下以Ni-NTA亲和纯化重组蛋白,以BCA法测定重组蛋白浓度,测得表达蛋白的产量分别为:18mg/L(pET28a-HA1/H1)、15mg/L(pET28a-HA1/H3)、10mg/L(pET32a-HA1/H3)、15mg/L(pET28a-HA1/H5)、12mg/L(pET32a-HA1/H9)培养物。用纯化的H5亚型SIV HA1重组蛋白作为检测抗原,建立了检测SI抗体的间接ELISA方法,并确定了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度为0.31μg/孔,包被液为0.05M Tris-HCl缓冲液(pH8.5);待检血清稀释度1:100;封闭液为5%脱脂奶,样品稀释液为含0.1%BSA、0.05%吐温-20的磷酸缓冲液;待检血清反应条件为37℃45 min,二抗为37℃30 min,底物溶液显色条件为37℃显色10min。特异性试验表明:上述ELISA方法特异检出H5亚型SIV抗体,与H1、H3或H9亚型SIV,以及猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等相关猪病阳性血清无交叉反应。重复性试验结果显示:同批抗原制备的不同检测板的批内变异系数(CV)值在2.6-14%之间,不同批抗原制备的检测板的批间CV值在19%以下。对临床猪血清的检测表明,ELISA方法与血凝抑制试验(HI)的阳性符合率为75.0%,阴性符合率为81.9%,总符合率为81.4%。ELISA方法对人工免疫猪流感抗体消长规律的检测结果也与HI相符,表明所建立ELISA方法能够检测抗体动态变化,为SIV的诊断与抗体监测提供了一种理想的技术手段。