唾液腺黏液表皮样癌中EpCAM和β-catenin的表达及意义黏液表皮样癌(MEC)是最常见的唾液腺恶性肿瘤[1],占唾液腺恶性肿瘤的30%左右,近年呈上升趋势,对人群健康构成严重威胁[2]。不同级别MEC的手术方式及预后不同,低分化MEC复发、转移风险均升高[3]。正确的组织病理学分级是临床上制定有效治疗方案的重要前提和保障。因MEC的生物学、组织学等存在多样性,所以病理医师正确诊断及明确MEC分级存在一定困难。现有的分级系统(AFIP系统和基于对AFIP系统改良而来的Brandwein分级系统)在评价过程中存在一定的人为主观性,目前尚无统一的辅助MEC分级、预测预后的客观分子标记物。上皮细胞黏附分子(EpCAM)和β-连环素(β-catenin)均可促进肿瘤的发生发展、预测预后。但关于两者在MEC中的作用尚未见相关报道。本研究用EnVision免疫组化法检测EpCAM和β-catenin的表达,探讨两者在MEC中的临床病理意义。1、对象与方法1.1研究对象选取2011年1月～2018年12月山西医科大学第一医院病理科存档资料完整的石蜡包埋MEC组织57例,其中男性20例,女性37例,年龄19～82岁(平均年龄50.75岁)。发生于腮腺19例(33.33%),颌下腺10例(17.54%),舌下腺5例(8.77%),腭部16例(28.07%),其它小唾液腺7例(12.28%)。依据AFIP分级法(见表1)分级:高分化22例(38.60%),中分化18例(31.58%),低分化17例(29.82%)。同时选取同期正常唾液腺组织20例。1.2试验方法与试剂标本常规经10%福尔马林固定,石蜡包埋,4μm连续切片,分别进行HE和免疫组化染色(EnVision二步法),试验步骤严格按照免疫组化试剂盒说明书。用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。小鼠抗人EpCAM单克隆抗体(工作浓度1∶200),兔抗人Beta-catenin(工作浓度1∶200)单克隆抗体,通用型试剂盒PV-6000和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥有限公司。表1MEC的AFIP评分系统1.3染色结果判定EpCAM以细胞膜/胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞,无着色或与背景颜色一致为阴性细胞。β-catenin以胞质/胞核着色作为阳性细胞。结果以阳性细胞百分比与着色强度进行综合评价。阳性细胞百分比得分:无阳性细胞为0分,阳性细胞1%～25%为1分,26%～50%为2分,>50%为3分;着色强度得分:无显色为0分,浅黄色为1分,深黄色为2分,棕黄色为3分;以两项评分之积作为判定结果,积分>4定为阳性表达。1.4统计学处理采用SPSS19.0软件进行统计学分析。采用χ2检验、Spearman秩相关检验等统计学方法,P<0.05为差异有统计学意义。2、结果2.1EpCAM和β-catenin在正常唾液腺组织和MEC中的表达EpCAM在正常组织中,导管上皮及浆液性腺泡的胞膜呈浅着色(图1a),在正常组织中EpCAM的阳性率为15.00%;在MEC组织中黏液细胞、表皮样细胞着色(图1),且着色强度增加,出现胞质着色。在MEC组织中的阳性率为57.90%,EpCAM在正常组织中与MEC组织中表达差异有统计学意义(P=0.002)。β-catenin在正常组织中细胞膜着色(图2a),在正常组织中阳性率为25.00%,在MEC组织中出现胞质或胞核表达(图2),阳性率为66.67%,差异有统计学意义(P=0.001)。2.2EpCAM和β-catenin与MEC病理分级的关系EpCAM在不同级别MEC组织中表达率分别为:高分化36.36%,中分化61.11%,低分化82.35%,差异有统计学意义(P=0.015)。β-catenin在不同级别MEC组织中表达率分别为:高分化45.45%,中分化72.22%,低分化88.24%,差异有统计学意义(P=0.016,表2)。2.3EpCAM和β-catenin与其它病理因素的关系EpCAM的表达与性别无关(P=0.169),而与患者年龄(P=0.004)、淋巴结转移(P=0.024)有关,差异有统计学意义(P<0.05)。β-catenin的表达与患者性别及淋巴结转移无关(P>0.05),而与患者年龄有关,≥50岁组与<50岁表达差异有统计学意义(P=0.004)。EpCAM和β-catenin的表达均与MEC发生部位无关,差异无统计学意义(P>0.05,表2)。2.4EpCAM与β-catenin表达的关系EpCAM和β-catenin在MEC中的表达呈正相关(R=0.480,P<0.001)。3、讨论EpCAM通过调节细胞间粘附、分化及迁徙等作用,参与多个系统的上皮源性恶性肿瘤的形成与恶性化进程。在非小细胞肺癌[4]、胃癌[5]研究中均发现EpCAM阳性率与肿瘤分期、淋巴结转移相关,提示EpCAM与肿瘤分级、恶性程度有关。在本研究中,EpCAM在正常组织中在浆液性腺泡中浅着色,而在MEC中,EpCAM主要表达于黏液细胞,表皮样细胞,且随着MEC分级的增高,胞膜着色更加均匀,阳性率增加,EpCAM在不同级别MEC中表达差异有统计学意义。并且EpCAM的阳性率与淋巴结转移有关。此结果与Kamal等[6]研究结果一致。图1EpCAM在正常组织(1a)和高(1b)、中(1c)、低(1d)分化MEC中的表达(EnVision,×100)图2β-catenin在正常组织(2a)和高(2b)、中(2c)、低(2d)分化MEC中的表达(EnVision,×100)本研究发现,在低分化MEC中EpCAM表达模式发生改变,胞膜表达缺失,胞质表达增加。Ralhan等[7]在甲状腺癌的研究中,EpCAM表达模式出现类似改变。可能的原因是肿瘤在进展过程中EpCAM发生裂解,胞膜上胞外结构域(EpEX)表达减少,而胞质中胞内结构域(EpICD)发生聚集,表达增加。有研究发现EpEX通过EGFR信号提高间充质干细胞的多能性[8],影响结肠癌的发展[9]。提示EpEX表达减少、EpICD表达增加可促进肿瘤恶性化进程。β-catenin与淋巴组织增强因子(LEF)/Tcf家族共同激活参与细胞转导。此为经典Wnt信号通路的主要途径,Wnt/β-catenin信号通路不仅在肝癌[10]、乳腺癌等[11]肿瘤的发生中起作用,而且是EMT的关键通路[12]。当受到刺激时,β-catenin构象发生改变,不能与降解复合体结合,而在胞质内发生堆积,激活Wnt/β-catenin通路,促进肿瘤细胞增殖[13]。本研究发现,β-catenin在正常唾液腺组织中呈细胞膜着色,而在MEC组织中,出现胞质着色,且随着分级的增高,β-catenin出现胞核表达。金雯等[14]在结直肠癌的研究中有类似发现,并且β-catenin细胞核表达与分化程度、淋巴结转移、临床Dukes分期及预后不良有关。本研究中,β-catenin的表达与淋巴结转移无关,分析原因可能与病例数少有关;但在有淋巴结转移的病例中,胞核表达率增加。β-catenin与淋巴结转移的关系有待进一步研究。EpCAM与β-catenin在MEC中的致瘤机制是否有协同作用尚不明确。Yu等[15]研究发现,Tcf/β-catenin复合物可与EpCAM结合,调节EpCAM基因的表达。此外,胞内蓄积的β-catenin和FHL2与EpICD形成的复合物,可激活下游靶基因启动子,从而促进OCT4,SOX-2等基因表达。Yamashita等[16]研究发现,EpCAM表达阳性的肝癌细胞可通过抑制β-catenin而死亡。表明Wnt/β-catenin可能通过调控EpCAM参与肿瘤的形成。在MEC中尚未见相关报道。本研究相关性分析表明,EpCAM与β-catenin在MEC中呈正相关,提示两者在MEC的发生发展中呈协同作用。综上所述,EpCAM和β-catenin对MEC的发生、发展及恶性化进程起作用,在MEC诊断中联合检测EpCAM和β-catenin有助于MEC的分级,辅助预测预后。此外,Cioffi的主要治疗方式为手术治疗,低分化MEC的术后5年生存率仅有25%,目前尚没有明显改善术后5年生存率的化疗药物。有关EpCAM的靶向药物已经进入临床试验阶段。Cioffi等[17]研究表明,EpCAM/CD3双特异性单链抗体MTl10对胰腺癌细胞有明显的杀伤作用。Strohlein等[18]发现catumaxomab(EpCAM的靶向药物)可用于结肠癌、胃癌及胰腺癌腹膜内扩散Ⅰ期和Ⅱ期的治疗。本研究将为MEC的靶向治疗提供新的思路。参考文献：[1]赵志国,高丹,王瑾,等.896例腮腺肿瘤临床回顾分析[J].上海口腔医学,2017,26(6):605-609.[3]许宁,朱恩新,刘婷姣,等.CyclinD1和ki-67与涎腺黏液表皮样癌发生及预后的相关性研究[J].口腔医学研究,2008,24(6):625-628.[4]毛建英,冯建中,盛陈卓娅,等.上皮细胞黏附分子在非小细胞肺癌组织中表达及其临床意义[J].中华外科学杂志,2016,33(11):2576-2579.[14]金雯,陈顺华,尹玉,等.β-catenin不同表达模式与结直肠癌临床病理因素的关系[J].临床与实验病理学杂志,2017,33(6):596-600.朱云娜,郑绘霞,肖虹,万惠丽,吕佳乐,梁钢,李宁.EpCAM和β-catenin在唾液腺黏液表皮样癌中的表达及意义[J].口腔医学研究,2020,36(05):433-436.
