神经生长因子对猴基底前脑神经元的保护作用临床医学论文.doc

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神经生长因子对猴基底前脑神经元的保护作用_临床医学论文【摘要】目的观察神经生长因子(NGF)对猴基底前脑神经元的保护作用，以探讨Alzheimer病的治疗方法。方法将6只老年恒河猴分为2组，将其脑内的穹隆切断，阻断NGF从大脑皮层至海马的神经通路，一组动物将能分泌人NGF的细胞微包囊移植到同侧侧脑室内，另一组移植不能分泌NGF的细胞。结果术后3～4周，隔区免疫组织化学检查显示，对照组隔区低亲和力神经生长因子受体(p75NGFr)阳性神经元较对侧减少53%，残余细胞呈萎缩状，而实验组只较对侧减少7%～23%；实验组的胆碱乙酰化酶免疫阳性神经元在隔区内计数比对侧减少0～37%，而对照组减少57%～75%；实验组的胆碱能阳性神经元的形态正常，对照组的神经元显示萎缩；实验组在隔区内可见胆碱能神经纤维及p75NGFr阳性神经纤维的发芽反应，对照组无此反应。结论神经生长因子对基底前脑神经元有一定的保护作用。关键字：神经生长因子神经元痴呆老年性移植【Abstract】ObjectiveTo study the preventive effects of nerve growth factor(NGF)on basal forebrain neurons to explore the therapy for Alzheimer disease.MethodsSix aged Rhesus monkeys were divided into two groups(group A and group B)randomly.NGF transport from cerebral cortex were blocked in all the monkeys.Group A received homopleural intraventricular implants of polymer-encapsulated cells that were modified to secrete NGF.Group B received identical implants of empty capsules.ResultsThree to four weeks after operation,the monkeys in the group B displayed extensive reductions in the number of p75NGFr receptor immunoreactive neurons(53%)and choline acetyltransferase immunoreactive neurons(57%to 75%)within the septum.The monkeys in group A appeared to be normal size relative to the atrophic appearance of cholinergic neurons and p75NGFr receptor immunoreactive neurons in the monkeys receiving control implants.ConclusionNGF could prevent basal forebrain neuron degeneration in aged monkeys.【Key words】Nerve growth factorsNeuronsDementia,presenileTransplantation神经病理和神经化学研究表明，老年性痴呆(Alzheimer病)患者由于脑内神经生长因子(NGF)缺乏，其脑内乙酰胆碱的浓度和合成明显降低，大脑皮质中出现老年斑，神经原纤维紊乱。由于NGF不能通过血脑屏障，本实验将能分泌NGF的细胞微包囊植入脑室内，通过检查移植后脑内基底前脑神经元的数量，来了解和确定NGF对基底前脑神经元的保护作用。材料与方法一、实验动物本组选用6只老年雌性恒河猴，年龄在24～29岁之间。二、手术方法医学论文网www.yixueda.com用氯胺酮将动物麻醉后再行异氟烷全身麻醉，气管插管，将头置于定向仪架上固定。取头顶部正中直切口，长约6 cm，牵开头皮，在右矢状窦旁用电钻磨一骨瓣，形成一1.5 cm×4 cm大小的骨窗。瓣形切开硬脑膜，翻向中线侧。在手术显微镜下牵开大脑纵裂，纵行切开胼胝体，从顶部打开侧脑室，在Moron氏孔水平可见一白色束状纤维即为穹隆，用一钝性小钩将其从底部钩起，切断。切断穹隆并确定无出血后，立即将5根装有能分泌人NGF的小牛肾纤维母细胞瘤细胞的多聚微包囊并排植入同侧侧脑室内。3只猴接受可分泌人NGF的细胞(实验组)，另3只猴接受的移植细胞不能分泌NGF，作为对照组。然后复置骨瓣，逐层缝合。动物自然苏醒［1］。三、组织学检查术后3～4周再次将动物麻醉，经原入路开颅，去骨瓣后在显微镜下取出微包囊，进行组织学和神经化学检查。开胸，从左心室灌注生理盐水，至右心房流出液清亮后，继续灌注浓度为400 g/L苦味酸固定液。开颅，完整取出脑，置于300 g/L的高糖溶液中，冰箱内冷冻保存。脑组织块脱水后，冰冻切片40μm厚，分别进行尼氏染色和乙酰胆碱酯酶(AchE)、胆碱乙酰化酶(ChAT)、多巴胺β-羟化酶(DβH)、β-淀粉样酶和低亲和力神经生长因子受体(p75NGFr)的免疫组织化学染色［2］。结果所有猴脑颞叶、顶叶、杏仁核和海马内的切片均可见有大量的β-淀粉样酶免疫阳性的斑块样结构，两组动物的斑块数量无差别。术后动物脑切片尼氏染色显示，位于侧脑室孔水平可见左侧穹隆完全被切断，导致同侧海马内的AchE阳性纤维较对侧明显减少。隔区免疫组织化学检查显示，对照组隔区p75NGFr阳性神经元较对侧减少53%，残余细胞呈萎缩状，而实验组只较对侧减少7%～23%；实验组的ChAT免疫阳性神经元在隔区内计数比对侧减少0～37%，而对照组则较对侧减少57%～75%。实验组的胆碱能阳性神经元的形态正常，而对照组的神经元显示萎缩。实验组在隔区内可见有胆碱能神经纤维及p75NGFr阳性神经纤维的发芽反应，而对照组则无此反应。有1只猴的1根微包囊被插入脑实质内，其NGF受体能阳性神经纤维在移植物周围形成网状。虽然这些神经纤维丛来自何处尚不清楚，但可以确定的是，这些纤维不是来自交感神经系统，因为这些纤维较细、迂曲，DβH免疫组织化学染色阴性。另外，在这些神经纤维丛内，也可见很少量的神经元，但由于其量太少，不可能形成网状。每只动物脑内移植的细胞囊在移植前每24小时可分泌(44.65±0.95)ng的人NGF，从动物脑内取出后每24小时可分泌NGF 9.6 ng。讨论本实验表明，将能分泌人NGF的细胞囊移植到切断穹隆的老年猴脑室内后，NGF对变性的老年灵长类动物的脑基底前脑神经元有营养效应和趋化效应。实验用猴的年龄相当于人75～87岁，对照组可见基底前脑的胆碱能神经变性明显，移植能分泌NGF的细胞后，有效地预防了胆碱能神经元的损伤和变性，还能诱导胆碱能神经纤维的发芽反应，在最老猴的脑内也可观察到这种变化。结合过去我们在年青猴所做的实验结果，可见这种效应在任何年龄的灵长类动物都是存在的。损伤和移植后，胆碱能神经元比神经生长因子受体能神经元对这种效应更敏感。由于NGF不能容易地通过血脑屏障，微包囊移植可能成为一种有效的途径。因为这种微包囊可使具有营养作用的小分子双向通过，而免疫分子却不能通过，所以异体移植时不用免疫抑制剂也可长期存活。在移植物周围，只有很轻微的星形细胞增生，而微包囊内的细胞却存活很好，且分泌功能存在［3］。NGF已被用于治疗由于胆碱能神经元缺乏所引起的老年性痴呆病，Olson等［4］对1例患者静脉注射NGF，发现其记忆能力有所改善，而其它认识能力无改善。我们认为，在NGF广泛应用于临床之前，应当认真评价其在灵长类的效应、最佳剂量和给药途径。我们曾在年青猴的研究中发现，移植前后微包囊内的细胞分泌能力相当，但本实验结果表明，移植数周后，微包囊内的细胞分泌能力下降，而此时仍对基底前脑神经元有影响，说明低水平的NGF即可成功地预防基底前脑神经元的变性，如果这种保护作用能持续存在，就可用这种方法来治疗老年性痴呆。参考文献[1]Williams L,Varon S,Peterson G,et al.Continuous infusion of nerve growth factor prevents basal forbrain neuronal death after fimbria formix transection.Proc Natl Acad Sci USA,1986,33:9231-9235.[2]Hsu SM,Raine L,Fanger H.Use of avidin-biotin peroxidase complex(ABC)in immunoperoxidase techniques:a compaison between ABC and unlabeled antibody(PAP)procedures.J Histochem Cytochem,1981,29:577-580.[3]Kordower JH,Liu YT,Winn S,et al.Encapsulated PC12 cell transplants into hemiparkinsonian monkeys:a behavioral,neuroanatomical,and neurochemical analysis.Cell Transplant,1995,4:155-171.[4]Olson L,Nordberg A,Von Holst H,et al.Nerve growth factor affects 11C-nicotine binding,blood flow,EEG,and verbal episodic memory in an Alzheimer patient(one case report).J Neural Transm,1992,4:79-95.