祖师麻注射液的高效液相指纹图谱研究药学论文.doc

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祖师麻注射液的高效液相指纹图谱研究_药学论文作者：刘妍，王胜利，毕慧敏，游富英，孙秀欣【摘要】目的建立祖师麻注射液HPLC指纹图谱，为中成药产品及生产工艺过程质量控制提供有效方法。方法色谱柱为VP ODS C18(4.6 mm×150 mm，5μm)，柱温为30℃，流速为1.0 ml/min，检测波长为326 nm，以乙腈和0.5%的醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。结果祖师麻注射液有8个共有峰，相似度>96%。结论该方法简便可靠，可有效用于祖师麻注射液生产过程中的质量控制和对产品的质量评价。【关键词】祖师麻注射液；高效液相色谱；指纹图谱中药质量控制技术是中药现代化的关键技术之一，HPLC指纹图谱技术正在越来越多地应用于中药质量控制［1，2］。祖师麻为瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香属植物黄瑞香(Daphne giraldii Nitsche)的根皮和茎皮，药理研究表明祖师麻具有较强的镇痛、抗炎、抑菌等药理活性，在临床上多用于风湿病痛的治疗，疗效显著。祖师麻含有香豆素类、二萜类、木质素类、黄酮类、蒽醌类及甾醇类等化学成分，其中祖师麻甲素（7，8-二羟基香豆精）又称瑞香素，为生理活性成分［3］。目前主要是通过祖师麻甲素含量的测定确定祖师麻注射液的质量［4，5］，关于祖师麻注射液各种指纹图谱技术研究未见报道。本实验对祖师麻注射液进行了HPLC指纹图谱研究，为祖师麻注射液内在质量的评价提供依据。1仪器与试剂岛津LC-2010A高效液相色谱仪，色谱柱：VP ODS C18(4.6 mm×150 mm，5μm)。乙腈为色谱纯，水为双蒸水，对照品祖师麻甲素（批号：110900-200405），购于中国药品生物制剂鉴定所，其他试剂均为分析纯。2方法与结果2.1对照品溶液的的制备精确称取4 mg祖师麻甲素对照品于10 ml的容量瓶中，加甲醇溶解并定容制成质量浓度为0.4 mg·ml-1的祖师麻甲素对照品溶液。2.2祖师麻注射液样品的来源和处理祖师麻注射液由山西万荣三九药业有限公司，批号分别为0710162，0711171，0801071，0801072，0801281，0801311，0802071，0804191，0902083，0902103。取注射液样品适量，用0.45μm微孔滤膜过滤，作为供试品直接进样。2.3色谱条件色谱柱为VP ODS C18(150 mm×4.6 mm，5μm)；体积流量1.0 ml·min-1；柱温30℃，检测波长326 nm；进样量10μl；流动相为乙腈～0.5%醋酸水溶液梯度洗脱；条件见表1。表1祖师麻注射液HPLC指纹图谱梯度洗脱表（略）2.4方法学考察2.4.1精密度实验取同一批号（0801072）供试品在上述色谱条件和测定方法下，连续进样5次，结果表明5次测定图谱中8个共有峰保留时间的RSD为0.08％～1.50％，峰面积的RSD为0.51％～1.89％。指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于99%，证明仪器精密度良好。2.4.2重复性实验取同一批号（0902103）供试品5份，分别用0.45μm的滤膜过滤测定，结果8个共有峰保留时间和峰面积的RSD分别为0.04％～1.35％和0.68％～1.85％，5个样品色谱图相似度大于99%，该方法重复性良好，稳定可靠。2.4.3稳定性实验同一批号（0801071）供试品，分别在0，2，5，8，12，16 h进样检测，色谱图中8个共有峰保留时间和峰面积的RSD分别为0.27％～1.54％和0.48％～1.98％，6次分析所得色谱图相似度大于99%，证明样品在16 h内稳定。2.5指纹图谱的测定及相似度计算按照选定的色谱条件对10个批次的祖师麻注射液成品进行指纹图谱检测，记录色谱图并积分，图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版，截取0～45 min的色谱图，按平均值法生成对照图谱，进行相似度计算，确定得到8个共有峰，见图1。各共有峰的保留时间和峰面积见表2，相似度见表3。8个共有峰的峰面积之和占总峰面积的90%以上，保留时间的RSD为0.32％，相似度>96%，符合指纹图谱研究技术的要求。按表1梯度色谱条件对祖师麻甲素对照品溶液进行测定，由保留时间得到3号峰为祖师麻注射液中有效成分祖师麻甲素特征峰。3讨论3.1流动相的选择本实验先采用了等度洗脱，发现用强洗脱能力的流动相时，出峰时间很早，且峰不能很好的分开，再用弱洗脱能力的流动相时，出峰少，且出峰时间太迟，故采用梯度洗脱。分别使用了乙腈-水，乙腈-0.5％磷酸，乙腈-0.5％醋酸，甲醇-水，甲醇-0.5％磷酸，甲醇-0.5％醋酸作用流动相进行线性梯度洗脱，用洗脱能力较强的乙腈时峰的分离情况较甲醇好，色谱峰窄，柱压低。在水相中加入磷酸或醋酸后，出峰明显增多，峰有较大的改善，而用醋酸时的基线较磷酸时平直，综合考虑，选用乙腈-0.5％醋酸作为本实验的流动相梯度洗脱。表2 10批祖师麻注射液HPLC指纹图谱共有峰保留时间和峰面积测定结果（略）表3 10批祖师麻注射液HPLC指纹图谱相似度测定结果（略）3.2检测波长的选择比较了254，285，305，315，326，330 nm时的色谱图，波长为326 nm时的色谱图最为理想，其它波长下在50 min后基线均有不同程度的飘移。3.3柱温的选择比较柱温为25，28，30，35℃时的色谱图，柱温在30℃以下时，个别成分峰吸收降低，分离度下降，在35℃以上时出峰时间提前，故本实验选择柱温为30℃。分析确定的色谱条件下生成的液相色谱图可见，此条件下色谱峰数目最多，分离度较理想，注射液主要成分即祖师麻甲素主峰突出；方法学考察显示本实验方法稳定、可靠，对评价祖师麻注射液的内在质量有一定的实用价值。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以10批祖师麻注射液的指纹图谱综合平均作为对照模板，计算10批样品共有峰的相似度，均大于96%，说明不同时间生产的祖师麻注射液质量稳定。但从指纹图谱中还可以看出，虽然都出现了相应的成分峰，但是峰面积比值不尽相同，说明不同批号的注射液在含量上存在明显差异，原因可能为所使用的原料来源和提取工艺不够稳定，所以必须在固定原药材产地及提取工艺的前提下，才可能保证中药注射液的质量稳定可控。由此可见，通过指纹图谱可以控制生产流程，可以及时、全面地对生产过程中的药材、中间产物及其成品进行质量监控，从而为提高成品的内在质量提供保证。【参考文献】［1］易伦朝，吴海，梁逸曾.色谱指纹图谱与中药质量控制［J］.色谱，2008，26(2):166.［2］周建良，齐炼文，李萍.色谱指纹图谱在中药质量控制中的应用［J］.色谱，2008，26(2):153.［3］李书慧，吴立军，殷红英.祖师麻化学和药理活性研究进展［J］.中国中药杂志，2002，27(6):401.［4］邓爱霞，柳仁民.RP-HPLC法测定祖师麻注射液中祖师麻甲素的含量［J］.中国药事，2005,18(3):42.［5］李皋，李及珍，谢景文.复方祖师麻注射液的制备工艺和质控方法［J］.中国中药杂志，1992，17(11):664.