幽门螺杆菌对大环内酯类抗生素的耐药机制及耐药性检测_临床医学论文【关键词】,幽门螺杆菌；,,大环内酯类抗生素；,,耐药机制；,,耐药性检测摘要：幽门螺杆菌是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病因，近年来幽门螺杆菌对大环内酯类抗生素的耐药率不断上升。关于幽门螺杆菌耐药机制的问题，目前还存在许多争议。随着检测技术的不断进步，现已发展了多种检测幽门螺杆菌耐药的分子生物学方法，本文就幽门螺杆菌对大环内酯类抗生素的耐药机制及耐药性检测方面作一综述。关键词：幽门螺杆菌；大环内酯类抗生素；耐药机制；耐药性检测The mechanism and detection of Helicobacter pylori resistance to macrolides ABSTRACT Helicobacter pylori(Hp)is the main of pathogen of chronic active gastritis and peptic ulcer(PU).Recently Hp resistance to macrolides has gradually increased,while with regard to resistant mechanism of Hp,there has been many debates.With the development of detection technology,many molecular biological methods are developed to detect resistance of Hp.In this paper,the mechanism and detection of Hp resistance to macrolides are reviewed.KEY WORDS Helicobacter pylori;Macrolides;Resistance mechanism;Resistance detection幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病因，并与胃癌、胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生密切相关。目前以大环内酯类抗生素尤其是克拉霉素为主的三联疗法成为根除Hp感染的主要方案。近年来，随着大环内酯类抗生素在临床上的广泛使用，导致Hp耐药菌株逐渐增多，给相关疾病的治疗带来诸多困难。克拉霉素对Hp敏感株的根除率大约为90%，对耐药菌株的根除率仅在0～50%之间。故阐明Hp对大环内酯类抗生素的耐药机制，以及早期检测Hp对抗生素的敏感性，对根除Hp感染治疗具有非常重要的临床意义。1 Hp对大环内酯类抗生素的耐药率变迁大环内酯类药物(以克拉霉素为代表)具有对酸稳定和在胃黏膜中浓度高、口服后生物利用率好和不良反应小等优点，是根除Hp治疗方案的主要抗菌药物，在临床广泛应用。20世纪80年代中期Hp对克拉霉素的耐药率几乎为0，其临床根除Hp的疗效良好，含克拉霉素的三联疗法与不含克拉霉素的三联疗法相比，Hp根除率提高10%～20%。但是随着使用时间的延长，Hp对克拉霉素的耐药率逐年升高，影响了克拉霉素的抗菌效果。目前许多国家和地区的耐药率发生了巨大的变化：1998年Glupczynski［1］对欧洲进行的多中心调查显示，Hp对克拉霉素的耐药率仅为99%；在亚洲，Tangmankongworakoon［2］等对泰国皇家医院2001～2002年间560例消化道疾病患者进行耐药研究，发现克拉霉素耐药率为190%。在某些发达国家，如日本东京［3，4］克拉霉素的耐药率从1989年的0上升到1995的62%，2001年达到221%；韩国首尔［5］历时16年的研究发现，1987年Hp对克拉霉素的耐药率为0，1994年上升至28%，2003年则达到138%。在保加利亚［6］，1994年Hp对红霉素和克拉霉素的耐药率分别为148%和87%，1998年Hp对克拉霉素的耐药率增加到125%，红霉素的继发耐药率远高于克拉霉素。在发展中国家，例如秘鲁地区［7］1995年Hp的耐药率高达50%。国内资料也显示，2001年北京地区Hp对克拉霉素的耐药率为135%；上海地区Hp的耐药率从1995年的0上升至1999年的10%；沈阳地区2002年Hp耐药率高达233%，可能与大环内酯类药物之间存在交叉耐药有关；2001年广东地区的原发耐药率为61%［8～12］。总之，克拉霉素的耐药率在不同国家和地区有所不同，一般而言发展中国家其耐药率普遍较发达国家更高，可能与当地的经济状况、文化以及教育都有一定的关系。Hp对克拉霉素的耐药已成为全球普遍性的问题，这可能与Hp原发耐药和临床上滥用抗生素有关，故了解Hp的耐药机制并合理使用抗生素在治疗Hp相关疾病中就显得至关重要。2 Hp对大环内酯类抗生素的耐药机制大环内酯类抗生素的抗菌机制是大环内酯类抗生素能进入细胞内结合在Hp23S rRNA功能区V区的50S大亚基上，抑制肽酰基转移酶，影响核蛋白体移位过程，抑制细菌蛋白合成和肽链延伸。Hp对大环内酯类抗生素的耐药机制目前认为有以下几种：①基因突变。Versalovic［13，14］等首次发现Hp23S rRNA基因多肽转移酶区的点突变与克拉霉素耐药性的产生有关，结果在Hp耐药菌株23S rRNA V区基因中发现2143和/或2144位点发生了A→G的突变(与大肠埃希菌2058和2059位相对应)，这一观点已得到许多研究者的证实。机理为Hp的23S rRNA的V区上发生了点突变，导致核糖体的构象改变，使大环内酯类抗生素结合位点也随之改变，Hp与大环内酯类亲合力下降，药物不能阻止细菌的蛋白合成，最终产生耐药性。但不同的研究者对与克拉霉素耐药有关的Hp23S rRNA点突变的两个位置记数不一致。Taylor［15］等通过引物的延伸，以核苷酸A作为Hp23S rRNA的5′末端，发现这两个与克拉霉素耐药有关的位置为A2142和A2143，并通过比较两者最低抑菌浓度(MIC)证实A2142G突变的MIC高于A2143G突变。Alarcon［16］等利用3′端错配特异引物PCR方法对克拉霉素耐药株进行检测时，未发现2142或2143位点A→G突变，结果得到一个包括A2142C突变的700bp的扩增产物，表明A2142C突变与克拉霉素的耐药有关，但较少见。Hulten［17］等的研究除得到A2143G和A2144G的突变菌株外，还发现一株具有A2116G和A2142G的突变。Fontana［18］等为探讨克拉霉素耐药性的新机制，对230例患者的胃黏膜标本进行Hp培养，结果86例标本中培养出Hp，其中12株具有克拉霉素耐药性，对该12株细菌的23S rRNA基因序列分析发现7个分离株在2717位具有T→C转换，并且产生了HhaI的限制位点。Scarpellini［19～21］等利用DGDGGE方法检测出在克拉霉素耐药菌株中还存在T2183C的突变，随后Khan等的研究也证实了这一结论，但最近的某些报道与此不同。由于不同地区的幽门螺杆菌有不同的基因特征，故有必要进行大规模的流行病学调查。在幽门螺杆菌耐药的菌株中，还存在其他形式的突变，如A2514G和A2515G，G2141A和G2142A。秦浩［22］等最近发现了3个与克拉霉素耐药相关的新突变位点，它们是G2224A、C2245T和T2289C。目前对于幽门螺杆菌的耐药位置和耐药形式还存在很多争议，需要更进一步的研究予以证实；②rRNA甲基化酶引起大环内酯类药物失活；③细胞膜渗透性下降使进入细菌的药物减少；④大环内酯类药物排出增加。目前国内、外学者普遍认为Hp对克拉霉素耐药的主要机制仍是23S rRNA基因突变所致，其余机制相对作用较弱。通过对Hp耐药机制的分子水平研究可以看出，临床上急需建立快速、准确的分子检测技术来分析Hp对大环内酯类药的耐药性以及耐药水平，以指导临床用药，提高疗效和减少抗生素的盲目使用。3 Hp对大环内酯类抗生素的耐药性检测Hp对抗生素的耐药性检测和地区性耐药率监测有助于了解人群中感染Hp耐药率变迁和指导本地区用药。随着对Hp耐药机制的深入研究和检测技术的发展，现已发展出多种对Hp耐药的检测方法，总的来说可以分为传统检测方法和分子生物学检测技术两大类。3.1传统检测方法传统的Hp耐药检测是在对Hp培养增殖的基础上，通过体外药敏试验获得结果。目前应用的方法大致分为琼脂稀释法、纸片扩散法和ETest试验，它们各有优、缺点。纸片扩散法操作简单，容易掌握，但受多种因素的影响，结果不够准确，且缺乏有效的判断标准和不能得出该药的MIC，故该方法的使用受到较大的限制；琼脂稀释法是NCCLS批准的试验方法，也是唯一被FDA批准的试验方法，技术要求较高；ETest法操作也较简单，但试纸价格较昂贵。3.2分子生物学技术由于Hp的生物学特性使体外药敏试验耗时较长，条件要求较高，因此运用快速、准确的分子生物学方法对Hp耐药进行检测具有明显优势。它可以不需要培养而直接应用于胃黏膜标本甚至胃液，结果更可靠，重复性更好。(1)聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析(PCRRFLP)基本原理为利用特异的引物对包含突变位点在内的Hp 23S rRNA基因片段进行扩增，由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点的出现，利用特异的限制性内切酶对PCR产物进行酶切，然后电泳分析，根据DNA片段长度的差异作出判断。Marais［23］等利用PCR扩增出23S rRNA肽酰基转移酶的片段(约425bp)，然后用BbsI和BsaI两种酶对其进行酶切，当存在2143位点A→G的突变时，可以被BbsI识别并将其切割为331和94bp两个片段；若存在2144位A→G的突变时，可以被BsaI识别，扩增产物被酶切为319和106bp的两个片段。Fontana［24］等成功地用PCRRFLP从患者粪便中直接取样进行突变检测，在125个粪便标本中扩增出约783bp的片段，然后用BsaI、BbsI和HhaI对产物进行切割，当存在A2142G突变时，可以被BbsI酶切为670和112bp两个片段；当存在T2717C突变时，可以被HhaI识别并将其切割为515、168和100bp三个片段，不存在此突变时仅产生615和168bp两个片段；当存在A2143G突变时，可以被BsaI酶切为671和113bp两个片段，根据电泳条带的不同可以得出突变的位置和形式。目前这项检测技术已在不同实验室中被运用。并且标本的获取逐渐从Hp培养过渡到从胃液或胃黏膜中直接取样［25］。(2)PCR寡核苷酸链接检测法(PCR oligonucleofideligafon assay，OLA)利用OLA检测Hp对克拉霉素的耐药基因时，需要5′端标记有生物素的俘获探针和5′端磷酸化，3′端标记有报告基团(如地高辛)的报告探针，标记有生物素的俘获探针可以识别Hp 23S rRNA基因的突变位点，通过DNA连接酶可以与报告探针相连接。通过生物素与亲和素之间的亲和力形成的双链连接产物，可以与已经固定在固相支持物上的亲和素结合，然后通过显色反应来判断是否存在突变和突变的类型［26］。(3)DNA酶免疫测定(DNA enzyme immunoassay，DEIA)此方法又分为酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶免疫测定(EIA)两种。ELISA是指将生物素酰基化的探针加入抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)包被的微量滴定板上，再加入变性的DNA，然后用标记的抗双链DNA的单克隆抗体进行检测；EIA的基本原理为通过相应底物被酶解后的显色反应进行判断，用酶标检测仪测定波长为450nm的光密度值(A450)，根据A450值绘制ROC曲线进行分析。Marais［23］和Pina［27］分别通过此技术进一步证实了A2143C、A2143G和A2144G等三种形式的突变与克拉霉素耐药之间的关系。(4)同源双链优先形成试验(preferential homoduplex formation assay，PHFA)PHFA是根据同源双链较异源双链优先形成的原理，将双标记的双链DNA探针［一股标记生物素，另一条标记二硝基苯酚(DNP)］与未标记的双链DNA样品进行混合、变性，当标记的DNA的序列与未标记的DNA序列相同时，同源双链之间可以进行杂交。由于未标记的DNA分子的稀释，双标记的双链DNA的比例将会减少。当两者的DNA序列不相同甚至仅一个碱基存在差异时，同源双链优先形成，双标记双链DNA分子的比例不会减少。在双标记双链DNA中，一条标有生物素的DNA链可通过生物素与亲和素之间的亲和力连接于亲和素包被的微量滴定板上，当加入碱性磷酸酶标记的抗DNP抗体和硝基苯酚磷酸盐(pNPP)，标有DNP的DNA链就可以通过与酶标DNP抗体和pNPP结合发生的显色反应进行检测［28］。因此，通过制备针对Hp 23S rRNA基因特定位点突变的双标记双链DNA探针，可以检测耐药的突变基因，该方法的敏感性可达到95%以上。与PCRRFLP法比较，PHFA可以在一个微量滴定板上同时检测多个样品；通过制备特异探针可以检测各种突变，并且能准确的检测混合感染。由于突变菌株和野生型菌株可能定植于胃的特定部位，所以从胃液提取DNA检测比从单一胃活检组织块中提取DNA检测耐药更准确，而PHFA正是第一种将胃液作为标本的检测方法。(5)PCR线性探针分析(PCRLine probe assay，PCRLiPA)PCRLiPA是指利用生物素化的引物扩增Hp 23S rRNA基因片断，扩增产物经变性后与平行固定在硝酸纤维素薄膜上的特异的寡核苷酸探针杂交，通过抗生物素蛋白链菌素一碱性磷酸酶鳌合物及特殊的显色来判断基因突变位点。van Doorn［29］等将此技术与DNA测序、限制性片段长度多态性分析及分子杂交比较时发现，PCRLiPA在检测多重突变时敏感性更高。PCRLiPA能特异性的检测出23SrRNA部位的多种形式的突变，如A2115G和G2141A等，其对克拉霉素耐药的阳性预测和阴性预测的价值均在97%以上，表明此方法准确可靠，重复性好［30］。(6)荧光原位杂交(florescence insitu hybridization FISH)FISH是一种非放射性的原位杂交方法，其基本原理为在组织细胞切片上直接进行分子杂交，然后用特殊方法检测。Trebesius［31］首次成功地将原位杂交技术运用于对Hp感染和Hp对克拉霉素耐药的检测上，先制备一系列荧光标记的寡核苷酸探针，此探针能结合在16S rRNA或23S rRNA上，两者完全结合后，用荧光显微镜对有标记的完整细菌进行监测，可以检测球形变的Hp。与普通PCR相比，FISH不需制备大量的待测核苷酸，对于组织中含量极低的物质有较高的敏感性，还可以完整地保持组织和细胞的形态，FISH快速而准确，大约3h就能完成检测，但是需要荧光显微镜和荧光标记探针。Russmann［32］等将该技术用于检测胃黏膜标本中Hp的感染时发现，FISH比传统的细菌培养更加敏感和迅速，联合运用这两种方法检测Hp的感染时可以明显增加其敏感性。(7)实时聚合酶链反应(realtime PCR)Gibson［33］等最先将该技术用于检测Hp耐克拉霉素的突变基因上，他们将杂交技术和实时PCR以及融解曲线(melting curve)分析法三者有机地结合在一起。其基本原理是寡核苷酸探针与模板结合时，不匹配碱基将显著影响双链熔解温度(Tm)，Gibson等将Hp 23SrRNA基因片断、SYBR Green I染料(一种结合于dsDNA双螺旋区域的具有绿色激发波长的荧光染料)和5′末端携带有cy5荧光染料的探针一齐加入密闭毛细管中进行反应。Light Cycler用SYBR Green I的激发波长来照射毛细管并且通过测量荧光信号的强弱来监测扩增物的水平。探针与模板杂交后，SYBR Green I与cy5之间的荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer，FRET)能使cy5的荧光信号增强，由于SYBR Green I与cy5的激发波长不同而能被Light Cycler分别监测。当温度上升至融解温度(Tm)时，双链断开使cy5的荧光信号急剧减弱。由于探针与模板之间有碱基错配时的Tm值比完全配对时的Tm值要低，通过Light Cycler实时监测Cy5的荧光信号强度变化以及Light Cycler软件自动生成的融解曲线，便可判断耐药基因的突变。与PCRFLP相比，实时荧光PCR不易污染，且不需要酶切。Matsumura［34］等首次将两条标记有荧光基团的寡聚核苷酸探针引入PCR反应体系中，这两条寡聚核苷酸探针均与DNA模板的碱基配对，其中锚定探针的3′端标记了荧光基团(荧光素)，而检测探针的5′端标记了荧光基团(LCRed640)，当两个荧光基团之间只有1～5个碱基的距离时，便可以产生高效FRET，对于耐药基因突变的判断同样根据融解曲线进行。随后Oleastro［35］等运用此法成功的从胃粘膜中直接提取DNA检测耐药突变基因，由于A2142G和A2143G这两种突变类型的Tm值非常接近，故实时PCR难于区别，而对于A→G和A→C之间的突变很容易鉴别。Schabereiter［36］等运用这种方法同时检测Hp感染和耐药，还发现此方法也适用于大便标本。随着研究的进一步深入，Lascols［37］等在此基础上建立了实时定量PCR技术，在对Hp耐药进行检测的同时，还用Light Cycler对Hp感染进行定量检测。(8)其他其他分子生物方法有随机扩增DNA多态性(RAPD)、巢式PCR［38］以及DNA测序等。RAPD指随机选择寡聚核苷酸作为引物，以靶DNA为模板，在多个部位同时扩增DNA，根据电泳结果判断。毫无疑问，与上述众多方法相比，DNA测序是研究耐药基因的金标准，并且能够验证上述方法的可靠性。由于其能对基因序列进行快速准确的分析，因此DNA测序有可能成为Hp耐药检测的主要方法。随着科学技术的不断进步，将会有更新的技术如生物芯片进行耐药检测。参考文献［1］Glupczynski Y,Megraud F,LopezBrea M,et al.European multicentre survey of in 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