肾细胞癌及癌旁组织中TIP30蛋白的表达及临床意义临床医学论文.doc

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肾细胞癌及癌旁组织中TIP30蛋白的表达及临床意义_临床医学论文【摘要】目的探讨肾细胞癌组织中Tat结合蛋白（TIP30）的表达及其临床意义。方法采用SP免疫组织化学染色法对65例肾细胞癌组织及其癌旁组织中TIP30蛋白表达进行检测。同时采用Western印迹方法检测22例肾细胞癌及其癌旁新鲜标本中TIP30蛋白的表达。结果免疫组化结果显示，TIP30蛋白阴性表达率在肾癌组中为49.2%(32/65)，显著高于癌旁组织〔10.8%(7/65)〕(P＜0.01)差异有统计学意义;TIP30蛋白的阴性表达在肾癌各病理类型中差异无统计学意义(P＞0.05)；TIP30蛋白在肾细胞癌中的阴性表达与浸润程度(P＜0.01)、淋巴结转移(P＜0.05)以及肾静脉癌栓有关(P＜0.05)。Western印迹结果显示在77.3%(17/22)的肾细胞癌组织中有TIP30蛋白低表达。结论TIP30蛋白的阴性表达与肾细胞癌发生、发展有关;作为抑癌基因产物,TIP30蛋白可在蛋白质水平为临床估计病情及预后提供一个有意义的客观指标。【关键词】肾细胞癌；TIP30蛋白；免疫组化；Western印迹TIP30,是一种30kD的Tat(Transactivator of transcription)结合蛋白（TatInteractive Protain），又称HTATIP2(HIV1 Tat interactive protein 2)，是近年来国外学者发现的一种肿瘤转移抑制基因〔1，2〕，其编码产物TIP30/CC3蛋白具有丝氨酸、苏氨酸激酶活性，可特异地调节基因转录〔1，3〕。TIP30/CC3基因敲除小鼠的研究表明,缺失TIP30/CC3的小鼠能自发引起肝细胞癌、膀胱移行细胞癌、平滑肌瘤、卵巢脂肪细胞瘤和血管肉瘤等肿瘤的发生〔4〕。目前,TIP30与肾细胞癌的关系尚未见报道。本研究采用SP免疫组织化学染色法及免疫印迹杂交实验(Western印迹),对肾细胞癌组织及其癌旁组织中的TIP30蛋白进行了检测，旨在探讨肾细胞癌中TIP30蛋白的表达情况及临床意义，认识TIP30蛋白在肾细胞癌发生、发展中的作用。1材料与方法1.1一般资料肾癌新鲜组织标本取自我院2006年9月至2007年5月肾癌手术病例,均经病理学检查确诊，共22例。男性13例，女性9例；年龄31～68(平均61.5)岁。其中透明细胞癌14例，颗粒细胞癌5例，混合细胞癌3例。Robson分期为Ⅰ、Ⅱ期者17例，Ⅲ、Ⅳ期者5例。全部标本于手术时收集，并立即放入液氮中冻存。肾癌组织取自原发癌灶，癌旁肾组织取自距癌灶≥5 cm的肾脏组织，并经病理学检查未见癌细胞。肾癌石蜡标本取自我院2006年6月至2007年12月肾癌手术病例65例,均经病理组织学确诊,手术前均未接受化疗及放疗。其中透明细胞癌46例，颗粒细胞癌6例，混合细胞癌13例。年龄17～75(平均56.4)岁,男性46例,女性19例。局限于肾内者53例,穿透肾包膜者12例,有局部淋巴结转移者9例,有静脉癌栓形成者5例。Robson分期Ⅰ、Ⅱ期者53例，Ⅲ、Ⅳ期者12例。癌旁组织为距肿瘤组织≥5 cm处的肾组织。1.2试剂兔抗人TIP30 IgG多抗购自英国Abcam公司,SP免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。Western印迹试剂盒购自碧云天生物技术研究所。1.3实验方法1.3.1免疫组织化学采用SP免疫组化染色法进行检测，主要操作步骤如下:石蜡切片标本经常规脱蜡,抗原高压修复,消除内源性过氧化物酶,山羊血清封闭非特异性抗原,加一抗(工作浓度为1∶100)4℃冰箱过夜,第2天切片恢复室温后,依次加生物素标记的二抗及链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液,DAB显色,苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明封片。用PBS代替一抗作阴性对照。1.3.2 Western印迹在低温下使用研钵将新鲜肾癌组织及配对癌旁正常组织磨成粉末状，加入蛋白裂解缓冲液及蛋白酶抑制剂,离心吸出上清,分装,测蛋白浓度后置-70℃冰箱保存。配制聚丙烯酰胺凝胶,将变性蛋白样品加入缓冲液,蛋白凝胶电泳,然后转膜(PVDF膜)，用5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜上的蛋白潜在结合位点,加入一抗(工作浓度为1∶400)4℃过夜,加入二抗后ECL试剂显色、照相。1.4结果判断免疫组化结果以胞浆内出现淡黄色至棕黄色颗粒为阳性细胞标志，采用双盲法，计数10个高倍视野，计算阳性细胞占细胞总数的百分率。染色结果分为阴性(-):细胞无染色或很弱，阳性细胞率＜5%；弱阳性（+）：细胞染色为淡黄色，阳性细胞率为5%～25%；阳性（）：细胞染色强度介于弱阳性与强阳性之间，阳性细胞率为26%～50%；强阳性（）：细胞染色为黄色至棕黄色，阳性细胞率＞50%。Western印迹结果采用BioRad图像分析系统分析目的蛋白及内参蛋白的IOD值，以相对积分光密度（TIP30的IOD值/GAPDH的IOD值）比较蛋白表达高低。计算每组均值(x±s)，比较癌组织与癌旁组织间的表达差异。1.5统计学方法采用SPSS10.0统计软件,两因素间的差异比较及相关性分析采用χ2检验。2结果2.1 TIP30蛋白Western印迹分析结果Western印迹结果显示，TIP30蛋白在77.3%(17/22)肾癌组织中的表达水平明显低于对应的癌旁肾组织,在22.7%(5/22)肾癌组织中的表达水平与癌旁肾组织无明显差异。肾癌组与癌旁组比较，肾癌组蛋白相对表达量为0.405±0.152，明显低于癌旁对照组的0.712±0.193(P＜0.05)。TIP30分子量为30 kD，GAPDH分子量为40 kD。见图1。图1 Western印迹检测TIP30蛋白在肾癌(C)与配对癌旁组织(N)中的表达差异（略）2.2 TIP30蛋白SP免疫组织化学染色结果分析2.2.1 TIP30蛋白表达与肾细胞癌侵袭、转移的关系TIP30蛋白主要表达于胞质,阳性染色细胞呈浅黄色至棕黄色颗粒，在肾近曲小管和远曲小管表达量高(图2)。TIP30蛋白在肾细胞癌和癌旁组织都能检测到表达。65例肾原发癌组织中，TIP30蛋白阴性32例，阴性表达率为49.2%；65例癌旁组织中，TIP30蛋白阴性表达7例，阴性表达率为10.8%；12例穿透肾包膜的癌组织中，TIP30蛋白阴性表达9例，阴性表达率为75%；9例肾细胞癌转移淋巴结癌组织中，TIP30蛋白阴性表达6例,阴性表达率为66.7%；5例肾细胞癌静脉癌栓中,TIP30蛋白阴性表达3例，阴性表达率为60%。各组与原发癌组之间的差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。图2肾细胞癌及癌旁组织中TIP30蛋白的表达(×400)（略）表1 TIP30表达与肾癌侵袭、转移的关系（略）与肾原发癌组织比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01 2.2.2 TIP30蛋白与肾细胞癌临床分期的关系按Roboson分期，Ⅰ～Ⅱ期的53例肾细胞癌组织中,TIP30蛋白阴性表达24例,阴性表达率为45.3%；Ⅲ～Ⅳ期的12例肾细胞癌组织中，TIP30蛋白阴性表达10例,阴性表达率为83.3%。Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期肾细胞癌组织中TIP30蛋白表达的差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。表2 TIP30表达与肾癌临床分期的关系（略）与Ⅰ～Ⅱ期比较：1）P＜0.05 2.2.3 TIP30蛋白与肾细胞癌临床病理分型的关系46例肾透明细胞癌组织中，TIP30蛋白阴性表达22例,阴性表达率为47.8%；6例肾颗粒细胞癌组织中，TIP30蛋白阴性表达3例,阴性表达率为50.0%；13例混合细胞癌组织中,TIP30蛋白阴性表达7例,阴性表达率为53.8%。各病理类型间TIP30蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。表3 TIP30表达与肾癌病理分型的关系（略）3讨论TIP30基因是Xiao等〔1〕在研究人类免疫缺陷病毒(HIV)的体外转录时发现的，序列分析发现TIP30与肿瘤转移抑制基因CC3为同一蛋白。CC3基因是1997年Shtivelman等〔2〕利用RNA差异显示技术发现的一种肿瘤转移抑制基因。TIP30/CC3定位在人类第11号染色体短臂上(11p15.1),由6个外显子组成，基因序列表明它是一个编码242个氨基酸残基的蛋白。近年来研究表明，TIP30基因具有促进肿瘤细胞凋亡〔5〕、抑制肿瘤血管形成〔6〕、抑制肿瘤转移〔7〕等作用。目前在多种肿瘤中均发现TIP30基因的表达有明显下调的趋势。Zhang等〔8〕研究显示TIP30表达降低与人肝癌发生相关,并且与肝癌的侵袭和转移有关。Zhao等〔9〕应用免疫组化方法证明TIP30的表达与乳腺癌患者的腋窝淋巴结转移和血管侵袭呈负相关。多项研究表明TIP30的抑癌作用是通过调节与细胞增殖、凋亡及血管生成的相关基因有关。TIP30与肾细胞癌的关系目前尚未见报道。本实验中TIP30蛋白的阴性表达率在肾细胞癌组织中为49.2%，显著高于癌旁正常组织，表明TIP30蛋白的阴性表达可能与肾细胞癌的发生、发展有关。本实验还表明TIP30蛋白的阴性表达与肾细胞癌肿瘤浸润程度、淋巴结转移及有无静脉癌栓等因素有关，而这些临床病理因素对肾细胞癌的恶性程度和预后有着重要的影响。因此检测TIP30蛋白的表达可能成为判断肾细胞癌恶性程度以及预后的一个重要指标。【参考文献】1 Xiao H，Tao Y，Greenblatt J,et al.A cofactor，TIP30，specifically enhances HIV1 Tatactivated transcription〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1998；95:214651.2 Shtivelman E.A link between metastasis and resistance to apoptosis of variant small cell lung carcinoma〔J〕.Oncogene，1997；14:216773.3 Xiao H，Palhan V，Yang Y,et al.TIP30 has an intrinsic kinase activity required for upregulation of a subset of apoptotic genes〔J〕.EMBO J,2000；19:95663.4 Ito M，Jiang C，Krumm K,et al.TIP30 deficiency increases susceptibility to tumorigenesis〔J〕.Cancer Res，2003；63：87637.5 Whitman S，Wang X，Shalaby R,et al.Alternatively spliced products CC3 and TC3 have opposing effects on apoptosis〔J〕.Mol Cell Biol,2000；20：58393.6 NicAmhlaoibh R，Shtivelman E.Metastasis suppressor CC3 inhibits angiogenic properties of tumor cells in vitro〔J〕.Oncogene,2001；20:2705.7 Liu Y，Thor A,Shtivelman E,et al.Systemic gene delivery expands therepertoire of effective antiangiogenic agents〔J〕.J Biol Chem,1999；274:1333844.8 Zhang X，Ouyany XN，Xuenong O.The correlation between the expression of TIP30 and of VEGF in human HCC tissues and its cell line〔J〕.Chin J Clin Oncol,2005；32:48992.9 Zhao J，Ni HD，Ma YC,et al.TIP30/CC3 expression in breast carcinoma:relation to metastasis，clinicopathologic parameters，and P53 expression〔J〕.Human Pathology,2007；38:2938.