去卵巢痴呆模型大鼠胆碱乙酰转移酶和脑源性神经生长因子的变化及倍美力的影响临床医学论文.doc

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去卵巢痴呆模型大鼠胆碱乙酰转移酶和脑源性神经生长因子的变化及倍美力的影响_临床医学论文作者：赵珩于雪凡孟霖赵珺张昱【摘要】目的观察去卵巢后痴呆模型大鼠额叶、海马CA1区胆碱乙酰转移酶（ChAT）和脑源性神经生长因子(BDNF)的变化及倍美力（Premarin）对其的影响，探讨倍美力的脑保护作用机制。方法采用穹窿海马伞切除术及双侧卵巢切除制备痴呆及雌激素缺乏复合模型大鼠，采用Morris水迷宫观察其行为学改变，利用免疫组化法检测各组大鼠额叶、海马CA1区ChAT及BDNF阳性神经元的数量。结果倍美力组大鼠额叶、海马CA1区ChAT、BDNF阳性神经元数量增加，与模型组比较有显著差异(P＜0.01)。结论倍美力可同时增加额叶、海马CA1区ChAT、BDNF阳性神经元含量，从而改善中枢胆碱系统的功能，实现其脑保护作用。【关键词】老年性痴呆；胆碱乙酰转移酶；脑源性神经生长因子；倍美力【Abstract】Objective To observe the expressions of ChAT and BDNF in cerebral cortex and hippocammpi CA1 of rats after ovariectomized and transected hippocampal fimbriafornix and the effect of Premarin.To discuss the principle of brain protection of Premarin.Methods The model rats were established by ovariectomized and transected hippocampal fimbriafor nix.Morris water maze was used to test the abilities of learning and memory function in each group.The number of ChAT and BDNF positive neurons in cerebral cortex and hippocammpi CA1 were measured with immunohistochemistry in each group.Results The numbers of ChAT and BDNF positive neurons in the cerebral cortex and hippocammpi CA1 were increased in Premarin group.Conclusions Premarin could increase the numbers of ChAT and BDNF positive neurons，suggest that Premarin can further improve the function of cholinergic system in CNS.【Key words】Alzheimer′s disease(AD)；Choline acetyltransferase（ChAT）；Brianderived nerve growth factor（BDNF）；Premarin流行病学研究显示，阿尔茨海默病（AD）存在明显的性别差异，绝经期后妇女AD的发生较同龄男性高1.5～3倍〔1〕，由此推测内源性雌激素水平减低与AD的发生有关，雌激素具有一定的脑保护作用。那么，外源性雌激素对AD是否有效成为研究的热点。结合雌激素倍美力（Premarin）是从孕马尿液中提取的一种结合型雌激素，是治疗去势或原发性卵巢功能减退所致雌激素低下症、预防和控制骨质疏松等的有效药物。倍美力是否可以用来治疗AD，在中枢神经系统内作用靶点、其脑保护作用的机制是本研究要解决的问题。中枢胆碱能系统与记忆的形成和储存有关，胆碱乙酰转移酶（ChAT）活性下降与痴呆密切相关〔2〕。本研究在建立雌激素缺乏及痴呆复合模型鼠基础上，观察了AD模型大鼠额叶、海马CA1区ChAT和脑源性神经生长因子(BDNF)阳性神经元数量的变化及倍美力对其的影响，探讨倍美力脑保护作用机制，为治疗AD提供理论依据。1材料与方法1.1试剂与仪器雌激素(倍美力，Premarin)购自上海通用药业股份有限公司；ChAT和BDNF均为兔抗大鼠抗体，购自北京博奥森生物工程有限公司。免疫组化SP法试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新试剂公司。1.2方法1.2.1动物分组与模型制作健康雌性Wistar大鼠30只，鼠龄4个月，体重250～300 g，由吉林大学基础医学部实验动物中心提供。随机分成对照组、模型组、倍美力组，每组10只。模型组及倍美力组：参照大鼠脑立体定位图谱取前囟后2.2 mm，中线左右各旁开1.0 mm处，牙钻钻开颅骨，切开骨膜，用双刃刀片在上述部位的脑表面行冠状切口，然后降刀4.5 mm，上下提抽刀20次，确保双侧海马伞外侧缘完全切断，制备痴呆模型。1 w后将上述20只鼠麻醉后切除双侧卵巢制备雌激素缺乏痴呆复合模型；对照组：仅做颅骨钻孔，不切断海马伞，仅切开腹腔，切除少量卵巢周围脂肪。1.2.2给药方法所有实验动物术后给予常规喂养，卵巢切除术后2 w，倍美力组大鼠灌胃（0.065 mg·kg-1·d-1，溶于1.5 ml生理盐水中）；对照组和模型组给予1.5 ml/d生理盐水灌胃，共8 w。1.2.3行为学观察定位航行实验：采用Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所）进行测试，历时4 d,将大鼠面向池壁，分别从四个入水点放入池中，记录大鼠寻找到平台所需时间即为逃避潜伏期。空间探索实验：定位航行实验结束后撤掉平台，将大鼠任选一入水点放入池中，测其2 min内跨越平台所在位置的次数，记录平均次数。1.2.4脑组织切片制备所有实验动物麻醉后，胸腹部联合切开，经左心室主动脉快速灌注生理盐水500 ml，继之用4%多聚甲醛250 ml灌注固定30 min，取脑，置于4%多聚甲醛（0.1 Mpb,pH7.4）中固定8 h，制成蜡块，常规石蜡切片厚约4～5μm，用于免疫组化检测。1.2.5 ChAT和BDNF免疫组化测试按文献方法进行〔3〕。每组各取相同部位5张切片，每张切片在10×40倍光学显微镜下观测，随机计数4个视野，计数ChAT和BDNF阳性染色细胞数量，取其均值作为各组阳性染色细胞数。1.3统计学处理实验数据以x±s表示，用SPSS13.0统计软件对数据进行处理，两组间比较采用Studentt检验。2结果2.1各组大鼠行为学测试结果见表1、表2。造模型前各组大鼠逃避潜伏期及跨越平台次数比较无显著差异(P＞0.05)，表明造模型前各组大鼠的学习、记忆能力无明显差异，各组间有可比性。造模型后，模型组、倍美力组与造模前比较，大鼠的逃避潜伏期时间明显延长（P＜0.01），跨越平台次数明显减少（P＜0.01），表明双侧阻断穹窿海马伞及双侧切除卵巢后，切断了胆碱能神经通路，胆碱能神经元受损；同时大鼠体内雌激素水平降低，导致大鼠学习、记忆能力减低，雌激素缺乏痴呆模型制备成功，为进一步实验奠定基础。补充倍美力治疗后，倍美力组大鼠逃避潜伏期明显缩短，跨越平台次数增加，与模型组比较有显著差异(P＜0.01)，提示倍美力可提高雌激素缺乏痴呆复合模型大鼠的学习、记忆能力。表1各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期测试成绩（略）与对照组比较：1）P＜0.01；与模型组比较：2）P＜0.01；下表同表2各组大鼠Morris水迷宫跨越平台次数测试成绩（略）2.2 ChAT和BDNF免疫组化测试结果见表3、表4。各组大鼠额叶、海马CA1区均可见ChAT和BDNF阳性神经元，胞浆染色呈棕色或棕黄色。对照组大鼠额叶、海马CA1区可见到大量的ChAT和BDNF阳性神经元，细胞层次清晰，细胞排列整齐、紧密。模型大鼠额叶、海马CA1区ChAT和BDNF阳性神经元数量明显减少，细胞层次紊乱，细胞排列稀疏、无序，胞体小、染色淡，与对照组比较差异显著（P＜0.01）。倍美力组大鼠额叶、海马CA1区可见较多的ChAT和BDNF阳性神经元，细胞层次较清晰，细胞排列较整齐，与模型组比较差异显著（P＜0.01），说明倍美力可增加额叶、海马CA1区ChAT和BDNF阳性神经元含量，从而该善中枢胆碱能神经系统的功能。表3各组大鼠额叶、海马CA1区ChAT阳性神经元（略）表4各组大鼠额叶、海马CA1区BDNF阳性神经元（略）3讨论研究认为海马及大脑新皮质是与学习、记忆密切相关的组织结构，基底前脑的神经元大部分属于胆碱能神经元，其发出突起投射到海马、扣带皮质和半球对侧面，包括额叶、顶叶、颞叶等，是大脑皮质胆碱能神经支配的主要来源，所释放的ACh占大脑皮质释放ACh的绝大部分。AD患者脑脊液中ACh水平与痴呆的程度呈负相关。ACh是与学习、记忆等认知功能密切相关的重要神经递质之一〔4〕，由ChAT催化合成，由AChE催化分解，通过与ACh受体结合而发挥其生物学效应，ChAT与AChE协调作用来维护ACh的动态平衡。ChAT在胆碱能神经元胞体内合成，与ACh的分布几乎平行，故常作为胆碱能神经的标志酶，是估计ACh含量的间接指标〔5〕。AD患者脑中ChAT活性下降，且与痴呆程度呈正相关〔6〕。在AD患者脑内基底前脑胆碱能神经元明显丢失，胆碱能神经纤维发生退变，其神经元丢失的程度和认知能力呈负相关关系。BDNF是神经生长因子(nerve growth factor，NGF)家族成员之一，可促进神经元增殖和分化，调节中枢及外周神经元存活和轴突生长，BDNF对维护神经元正常的生理功能以及对周围神经和中枢神经元的生存、分化、生长起着关键的作用。尤其可以提高基底前脑胆碱能神经元ACh的释放及隔核、海马的ChAT活性，增加隔核内胆碱能神经元的数目。在AD病人大脑皮质和海马中BDNFmRNA表达明显减少，引起对胆碱能神经元支持减少，进而导致神经元变性。BDNF的缺乏可导致学习、记忆能力障碍〔7〕。在AD病理特征性变化老年斑内也发现BDNF免疫活性物质，这说明BDNF可能参与了神经元变性或其代偿机制。啮齿动物切断海马伞后，BDNF对切断的胆碱能神经元也有支持作用。大量实验研究证实成体动物的大脑皮质、海马、基底节、小脑及脑干等组织中均有BDNF表达，提示其在维护中枢神经系统功能中起重要作用。BDNF基因敲除鼠其空间学习、记忆能力也大大降低，充分表明BDNF参与了海马依赖的空间学习、记忆过程。动物研究发现，去卵巢大鼠体内雌激素水平降低，其大脑皮质和海马对合成ACh的原料胆碱的高亲合力摄取减少，ChAT活性降低，脑内BDNF的mRNA水平降低，大鼠回避反应减少和空间记忆减退。提示雌激素、ChAT及BDNF之间可能存在着相互依存的关系，三者协同作用的结果可改善动物的学习及认知能力。本实验观察到雌激素缺乏痴呆模型组大鼠额叶、海马CA1区ChAT及BDNF阳性神经元表达数量明显减低，大鼠学习、记忆能力下降；给予倍美力治疗后大鼠额叶、海马CA1区ChAT及BDNF阳性神经元表达数量明显增加，大鼠学习、记忆能力改善。提示倍美力可同时提高雌激素痴呆模型大鼠额叶及海马CA1区ChAT及BDNF阳性神经元表达，二者协同作用有利于促进中枢胆碱能神经元的功能，改善动物的学习、记忆能力，实现其脑保护作用。倍美力的脑保护作用机制目前尚不完全清楚。近年来相关的研究发现，雌激素受体（estrogen receptor，ER）与低亲和力神经生长因子受体（nerve growth factor receptor，NGFR）共存于基底前脑胆碱能神经元内，说明雌激素和NGF之间存在相互作用的基础，雌激素可增加NGFR的表达，通过协同作用共同调节神经元的存活、分化、再生，雌激素的缺乏可导致胆碱能神经元的萎缩和死亡，提示中枢胆碱能神经元受雌激素和NGF的双重作用。绝经期后妇女的雌激素水平长期缺失可引起与衰老有关的基底前脑胆碱能神经元功能减退，ChAT活性降低，BDNF表达下降，而雌激素替代治疗可逆转这种损伤，补充雌激素后可增加ChAT的活性，促进ACh的释放，延长胆碱能神经元的存活，尤其可显著增加海马CA1区、皮质区、杏仁复合体区、Meynert核区BDNF的表达，这与雌激素对多种NGF之间的调节作用，以及对NGFR之间的相互作用和保护效用有关〔8，9〕。本研究应用倍美力在动物模型中同样观察到了倍美力可提高脑内ChAT及BDNF表达，改善动物的学习、记忆能力，具有脑保护的作用。故可推测，倍美力和BDNF之间可能存在相互作用的基础，可以通过协同作用共同调节内源性的ChAT和BDNF的表达，促进胆碱能神经元的存活、分化、再生，从而减轻受损脑组织的病理改变，提高雌激素缺乏痴呆模型大鼠的学习、记忆能力，为倍美力可能用于临床治疗AD提供一定的理论依据。【参考文献】1 Bieber EJ，Cohen DP.Estrogens and hormone replacement therapy；is there a role in the preservation of cognitive function〔J〕?Int J Fertil Womens Med，2001；46(4)；2069.2 Dekosky ST，Ikonomovic MD，Styren SD,et al.Upregulation of cholineacetyltransferase activity in hippocampus and frontal cortex of elderly subjects with mild cognitive impairment〔J〕.Ann Neurol，2003；51(2)：14555.3赵宗江.组织细胞分子学实验原理与方法〔M〕.北京：中国中医药出版社，2003；9：192201.4 GilBea FJ，GarciaAlloza M，Dominguez 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