大孔吸附树脂纯化马钱子总生物碱的工艺研究药学论文.doc

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大孔吸附树脂纯化马钱子总生物碱的工艺研究_药学论文作者：管庆霞，王录娜,李永吉,杨志欣，王锐【摘要】目的研究大孔树脂纯化马钱子总生物碱的工艺条件，为马钱子总生物碱的工业化生产提供实验依据。方法以吸附量及解吸率为指标考察了AB-8,D101,HPD-500和LSA-10等4种型号的树脂,确定纯化马钱子总生物碱的最佳树脂。并通过单因素分析考察该树脂分离、纯化马钱子总生物碱的最佳工艺条件。结果AB-8型大孔吸附树脂对马钱子总生物碱具有较好的分离能力。通过大孔树脂分离纯化后,马钱子样品总生物碱的纯度可达70%,洗脱率可达到90%以上。结论AB-8大孔吸附树脂综合性能较好,适合于马钱子总生物碱的分离纯化。【关键词】马钱子总生物碱大孔吸附树脂纯化马钱子为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子［1］，具有通络止痛、散结消肿的功效，在我国有悠久的药用历史，疗效显著、确切，为历代医家所推崇。现代研究证明其主要含总生物碱（其中最主要的成分为士的宁、马钱子碱）。因此,分离纯化马钱子总生物碱具有重要的意义。大孔吸附分离技术是目前应用较广的一种中药深加工技术,具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点［2］，已被广泛应用于中草药有效成分的分离纯化。但马钱子总生物碱的大孔吸附树脂的富集,分离和纯化尚未见报道。本实验选择4种大孔吸附树脂分离马钱子总生物碱，以士的宁和马钱子碱为定量指标，筛选出最佳的树脂、洗脱溶剂及用量，以达到开发相应制剂的要求。1仪器与试药Waters2695-2996高效液相色谱仪，含有在线脱气、高压四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（DAD）、Empower色谱工作站；HY-4型调速多用振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；AB265-S电子分析天平（德国梅特勒公司)；RE-52型旋转蒸发仪(上海青浦泸西仪器厂)。砂烫马钱子购于哈尔滨市同仁老号；甲醇（美国Dikma公司）为色谱纯;水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其它试剂均为分析纯。士的宁、马钱子碱对照品（中国药品生物制品检定所）；大孔吸附树脂AB-8、D101（南开大学化工厂）；LSA-10（西安蓝晓科技有限公司)；HPD-500(河北沧州宝恩化工有限公司)。2方法与结果2.1总生物碱含量的测定2.1.1色谱条件色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇水乙酸三乙胺（76∶230∶2.4∶0.3）；流速1.0 ml/min；检测波长254 nm；柱温30℃。2.1.2标准曲线的绘制精密称取士的宁对照品6 mg，马钱子碱对照品5 mg定容置同一25 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。分别精密移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml至10 ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。精密吸取10μl,注入液相色谱仪。以峰面积(A)为纵坐标,对照品浓度(C)为横坐标作图,得标准曲线。回归方程为:士的宁A=-87 369+22 961C，r=0.999 8马钱子碱A=-69 869+12 255C，r=0.999 7结果表明,士的宁浓度在24～120μg/ml,马钱子碱浓度在20～100μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。2.2样品溶液制备马钱子药材用6倍量pH=5,50%的乙醇溶液提取3次,回流提取2 h/次,合并3次滤液，抽滤。减压浓缩回收至无醇味,加水稀释到适当浓度备用。2.3大孔吸附树脂静态吸附和解吸试验考察2.3.1树脂预处理大孔树脂分别用95%乙醇浸泡24 h,充分溶胀,用乙醇洗至溶液加适量蒸馏水无白色浑浊现象时为止,最后用蒸馏水洗至无醇味,备用。2.3.2静态吸附容量测定精密量取预处理好的4种大孔吸附树脂1 g（湿重）加入马钱子样品液30 ml中,密封置于振荡器(25℃,100次/min)中振荡，充分吸附,12 h后从上清液中取样,检测溶液中总生物碱含量的变化,计算饱和吸附量。结果见表1。2.3.3静态解吸试验分别将上述充分吸附了马钱子总生物碱的4种树脂进行过滤,除去水液,再将其置于具塞锥形瓶中,加入95%乙醇溶液30 ml密封,置恒温振荡器中进行解吸,12 h后从上清液中取样,检测总生物碱含量变化,计算解吸率。结果见表1。饱和吸附量（mg/g）=［(初始浓度-吸附后浓度)×吸附液体积］/树脂重量（湿重）解吸率(%)=［洗脱液浓度×洗脱液体积］/饱和吸附量×100%由表1中数据可见,树脂AB-8对马钱子中总生物碱的吸附、解吸附性能最优,所以选择AB-8型树脂对马钱子进行纯化。表1 4种大孔树脂的静态饱和吸附量及解吸率（略）2.4静态吸附动力学特征取AB-8树脂1 g加入100 ml(0.05 g生药/ml)马钱子样品溶液中，室温条件下静置12 h,使其达到饱和吸附,静置期间，每隔一定时间吸取上层液测定士的宁、马钱子碱的含量。以吸附时间（h）为横坐标，吸附量（mg/g）为纵坐标，绘制吸附动力学曲线，见图1。可见，各成分在起始阶段吸附速率较大，2 h后士的宁、马钱子碱含量增加缓慢。2.5 AB-8树脂对纯化马钱子总生物碱的工艺研究2.5.1最大上样量的考察将一定浓度的马钱子样品液150ml缓慢加入装有15 ml AB-8树脂的玻璃柱中,流速为1.0 ml/min,每树脂床体积（Bed volume,BV)即15 ml收集1个流分,测定总生物碱含量。结果见表2及图2。可见,从第4流分开始,总生物碱出现少量泄漏,随着流分数的增加至7BV时，总生物碱含量明显增多，说明AB-8树脂对总生物碱的吸附量达到饱和。考虑到生产工艺中要避免造成总生物碱的泄漏,拟定最大上样量为1.4 g生药/g树脂(湿重)。表2最大上样量考察结果（略）2.5.2洗脱剂浓度的考察将4份各已吸附好5 ml马钱子提取液(1 g生药/ml)的AB-8树脂10 ml，先用水洗至无色，再分别用30%，50%，70%，90%的乙醇溶液作为洗脱液,洗脱5倍柱体积,洗脱液流速为1.0 ml/min。以士的宁、马钱子的含量为评价指标,测定结果见表3。可见，生物碱含量随乙醇浓度的增加而增大,30%,50%乙醇洗脱液中士的宁、马钱子碱含量较低,70%乙醇即可将绝大部分总生物碱洗脱。乙醇浓度超过70%以后,生物碱含量增加很小,考虑到随着洗脱液浓度的增加,洗脱液洗下杂质也会增多,并从节省成本方面考虑,选择70%的乙醇溶液作为洗脱液。2.5.3水洗脱用量的考察将已吸附好5 ml马钱子提取液(1 g生药/ml)的AB-8树脂10 ml，用蒸馏水洗脱至无色，每树脂床体积（10 ml）为1个考察单位，分段收集洗脱液，测定有效成分泄漏情况，见表4。吸附后用水冲洗对已吸附的总生物碱会有一定量的损失,水洗次数越多,损失量越大,但水洗可除去杂质,提高总生物碱纯度。考虑到树脂的除杂作用和减少洗脱用水及时间,选择3 BV为洗脱杂质用水量。表3洗脱剂浓度的考察（略）表4水洗脱用量的考察（略）2.5.4洗脱剂用量的考察将已吸附好5 ml马钱子提取液(1 g生药/ml)的AB-8树脂10 ml，用蒸馏水洗脱3 BV后，再用70%乙醇洗脱，每树脂床体积（10 ml）为一个考察单位，至洗脱液近无色，共收集5份，分别测定各BV洗脱液中士的宁、马钱子碱的含量。结果见表5。由表中数据可知,前4 BV 70%乙醇洗脱液可将绝大部分生物碱洗脱下来，第5 BV洗脱液中生物碱含量已极低。故确定洗脱剂用量为4 BV。表5洗脱剂用量的考察（略）2.6验证实验取马钱子样品液按上述方法选择的工艺条件进行吸附和洗脱,测定终干燥品中总生物碱的纯度可达70%,洗脱率可达到90%以上。3讨论本实验对4种大孔吸附树脂吸附马钱子总生物碱性能进行对比筛选,发现AB-8树脂最适合马钱子总生物碱的纯化。以士的宁、马钱子碱的含量为考察指标,对吸附容量、洗脱剂的乙醇浓度、洗脱剂用量等进行考察。试验结果表明,以70%乙醇为洗脱剂效果最佳,洗脱剂用量为4个柱体积。另分别测定纯化前、后样品液总固物量,计算总固物保留率,结果马钱子提取液经AB-8型大孔树脂吸附后,70%乙醇洗脱液总固物的量大约是纯化前总固物的25.12%,纯化后样品总生物碱中占总固物可达70%。总生物碱洗脱率为90.89%,说明采用优选出的工艺进行实验,可以明显减少总固物的得率,提高总生物碱在总固物中的含量。【参考文献】［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：34.［2］何伟,李伟.大孔树脂在中药成分分离中的应用［J］.南京中医药大学学报,2005,21(2):134.