金黄色葡萄球菌β-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备=“news_bd”>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，金葡菌)是一种自然界中广泛存在的革兰阳性菌，可引起人和动物的局部化脓性感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎以及败血症、脓毒败血症等，同时也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一[1]。金葡菌主要通过产生多种致病因子而致病，这些致病因子包括溶血素、杀白细胞素、肠毒素、凝固酶、耐热核酸酶等[2]。溶血素(hemolysins)，又称细胞溶素(cytolysin)，是由细菌分泌的能使细胞溶解的毒素[3]，是金葡菌产生的一种重要毒力因子，包括α、β、γ、δ4种。其中α、γ、δ又称作打孔毒素(pore-forming toxin)，即能跨细胞膜形成孔道，允许小分子和离子通过，从而使靶细胞代谢紊乱，最终裂解细胞。而β-溶血素作用机制与其他3种均不同，因此被称之为非打孔毒素[4]。β-溶血素(β-hemolysins，Hlb)，全长993 bp，编码330个氨基酸，1～34位氨基酸(aa)为其信号肽，相对分子质量为35×103。目前国内外对Hlb的研究很少。已有研究表明，Hlb是一种鞘磷脂酶C，能特异性地水解鞘磷脂[5]，Mg2+的存在能增强其生物活性[6]。且Hlb在体外具有独特的溶血活性:热冷效应(Hot-cold)溶血特性，即Hlb在37℃作用于红细胞，红细胞不易裂解，随后置于4℃红细胞则能够迅速裂解[7，8]。晶体结构表明，Hlb的第149位和287位的组氨酸(H)是其发挥生物学活性的关键性位点，将149或287位的组氨酸(H)突变为天冬酰胺(N)时，Hlb的鞘磷脂酶活性降低[9]。此外，Medora等[10]还发现Hlb具有结合核酸的活性。本研究以金葡菌NCTC-8325为模板扩增得到Hlb的全长序列，并构建了野生型Hlb蛋白的重组表达载体，利用点突变技术构建了突变体HlbH-149-N蛋白的重组表达载体，获得了Hlb及HlbH-149-N蛋白，验证其溶血活性，制备了Hlb的特异性抗体，并检测抗体的中和活性。
1材料与方法1.1材料NCTC-8325菌株、原核表达载体pET-28a为本室保存;感受态DH5α及BL21(DE3)、HiFiTaq聚合酶、dNTP(北京康润诚业生物技术公司)。原核表达载体pMD-19T、限制性内切酶(NdeⅠ、XhoⅠ，TaKa-Ra公司);质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];细菌基因组DNA提取试剂盒(赛百盛公司);T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、Trans2K plus DNA标志物(北京全式金生物技术公司);低相对分子质量蛋白标准(上海生化所);NiSepharose 6 Fast Flow纯化柱、CNBr-activated SepharoseTM4B亲和树脂(GE Healthcare生物科学公司);绵羊血(芳元养殖场);anti-His(鼠源)单克隆抗体、HRP标记羊抗鼠IgG(中杉金桥公司);医用X线胶片[锐珂(厦门)医疗器材有限公司];SuperECL发光液(北京普利莱基因技术有限公司)。其他试剂为国产分析纯。
1.2方法1.2.1 Hlb重组蛋白的表达1.2.1.1引物的设计和合成PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，正向引物:5'-CGCGGCAGCATATGGAATCTAAGAAAGATGAT-3';反向引物:5'-CACCACCACTCGAGCTATTTACTATAGGCTTTGA-3'，划线部分为酶切位点。
1.2.1.2 pET-28a-hlb重组质粒的构建以金葡菌菌株NCTC-8325基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应条件如下:94℃5 min;94℃30 s;60℃30 s;72℃60 s;30个循环;72℃10 min。扩增片段大小为891 bp。将PCR扩增得到的hlb基因片段连接至pMD-19T，测序正确并利用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，回收目的片段连入pET-28a载体，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，经菌落PCR鉴定获得阳性克隆。
1.2.1.3 Hlb蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及纯化挑取阳性克隆于LB(Kana+，50μg/ml)培养基中37℃培养过夜，次日按1∶100转接到新鲜的LB(Kana+，50μg/ml)培养基中37℃培养至D600约为0.4时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.05 mmol/L和葡萄糖至终浓度为0.25%，继续室温培养6 h，4℃8000 r/min离心15 min收集菌体。用超声缓冲液(20 mmol/L Na3PO4，0.5mol/LNaCl，20 mmol/L咪唑，pH 7.4)重悬菌体，超声破碎菌体，4℃12 000r/min离心5min，收集沉淀和上清，通过SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白在上清中的表达，接着将上清经Ni2+亲和柱进行层析纯化，先后通过含20 mmol/L咪唑浓度的洗涤液洗涤Ni2+柱，最后用含500 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白。
1.2.2 Hlb蛋白溶血活性验证将购买的新鲜羊血4℃1000×g离心10 min，收集红细胞，用生理盐水洗涤绵羊红细胞3次，每次4℃1000×g离心10 min。取1 ml绵羊红细胞用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L Na3PO4，0.015 mol/L NaCl，pH 7.0，PBS)反复洗3次，每次2000 r/min，10 min去上清，以上述磷酸盐缓冲液配制2%(V/V)的红细胞悬液。利用上述磷酸盐缓冲液配制1%PBSB溶液，随后将Hlb蛋白稀释至不同浓度。将2%绵羊红细胞悬液与稀释好的Hlb蛋白溶液等体积混合(200μl反应体系)，37℃温育1 h后置于4℃1 h，低速离心后取上清100μl，酶标仪测定其在波长405 nm的光密度值[11]。
1.2.3 Hlb蛋白对不同物种红细胞溶血活性测定将各物种(绵羊、小鼠、家兔、人)新鲜血液样品配制2%的红细胞悬液，以绵羊红细胞为阳性对照，将Hlb蛋白稀释至不同浓度(0，0.5，1.0，2.0，4.0和8.0μg/ml)。将2%不同种属红细胞悬液与稀释好的Hlb蛋白溶液等体积混合，37℃温育1 h后置于4℃1 h。低速离心后取上清用酶标仪测定其在波长405 nm的光密度值。
1.2.4多克隆抗体的制备以重组表达的Hlb蛋白为抗原免疫国产大耳白兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，经皮下注射接种Hlb蛋白1 mg/只，2周后分别以弗氏不完全佐剂乳化抗原经腹腔注射1次，第2次免疫后7 d，经耳缘静脉采血，ELISA法测定血清中抗Hlb蛋白抗体效价。间隔3～4周后加强免疫2次，ELISA再次测定抗血清效价。最终采取心脏放血得到其抗血清。
1.2.5亲和纯化Hlb抗血清中anti-Hlb IgG将Hlb蛋白偶联至CNBr-activated SepharoseTM4B树脂制备亲和柱，方法参见产品说明书。将免疫后的兔血清过滤除菌后，与制备的Hlb亲和树脂孵育，20倍体积PBS洗涤后，用Gly-HCl(0.2 mol/L，pH2.4)洗脱，并用Tris-HCl(1 mol/L，pH 9.1)中和至pH=7.4。
1.2.6多克隆抗体对Hlb蛋白溶血活性的抑制anti-Hlb(0.05μg)与不同浓度Hlb蛋白、2%的红细胞悬液等体积混合，37℃温育1 h后4℃静置1 h。低速离心后取上清100μl，酶标仪测定其在波长405 nm的光密度值。
1.2.7 pET-28a-hlbH-149-N重组蛋白的表达1.2.7.1突变体引物的设计与合成利用重叠PCR技术，将野生型hlb基因片段的第149位的组氨酸(CAT)突变为天冬酰胺(GAT)，设计引物，正向引物Fm:5'-CGCGGCAGCATATGGATGTTTTCAAAAGC，反向引物Rm:5'-CACCACCACTCGAGATCCTGGATTTTTTC，划线部分为酶切位点，全长引物参见1.2.1.1。
1.2.7.2 pET-28a-hlbH-149-N重组质粒的构建通过重叠PCR法对hlb基因进行点突变，首先以金葡菌NCTC-8325基因组为模板，利用全长正向引物F和突变引物Rm进行PCR扩增(PCR1)，同时以金葡菌NCTC-8325基因组为模板，用全长反向引物R和突变引物Fm进行PCR扩增(PCR2);纯化上述PCR产物，等比例混合PCR1和PCR2纯化产物使其为模板，加入全长正反向引物F和R、dNTP、HifiTaq酶进行PCR扩增，产物即为引入了目的突变的全长基因hlbH-149-N。
以上PCR循环条件均为94℃5 min;94℃30 s;60℃30 s;72℃60 s;共30个循环;72℃10 min。PCR反应总体积为25μl。酶切、回收、连接、转化、鉴定均参见Hlb蛋白的表达纯化。
1.2.7.3 HlbH-149-N蛋白在大肠杆菌中进行诱导表达及纯化参见1.2.1.3 Hlb蛋白的表达纯化。
1.2.8 HlbH-149-N蛋白溶血活性验证方法参见1.2.2中Hlb蛋白溶血活性验证。
1.2.9 Western印迹验证Hlb、HlbH-149-N蛋白的表达利用15%SDS-PAGE电泳分离重组的VraX蛋白，利用亲和纯化anti-Hlb抗体可特异性地检测重组Hlb、HlbH-149-N蛋白的表达情况。
1.2.10统计学分析所有试验均重复3次以上，各组数据用珋x±s表示，利用SAS9.0统计学软件进行数据分析，选用单因素重复测量方差分析和具有一个重复测量的两因素设计定量资料的方差分析来处理数据，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果2.1 Hlb重组蛋白的表达2.1.1 pET-28a-hlb表达载体的构建以NCTC-8325基因组为模板，PCR扩增获得hlb基因，琼脂糖凝胶电泳检测显示，扩增产物为约891 bp的单一条带(图1A)，与预期相符。继而将扩增产物克隆至pMD-19T载体，菌落PCR鉴定结果表明，PCR产物与pMD-19T连接成功。提取测序正确的阳性克隆质粒，通过酶切获得hlb片段并与pET-28a载体连接并转化BL21(DE3)感受态细胞，菌落PCR结果显示，hlb成功克隆至pET-28a载体。
2.1.2 Hlb蛋白的表达和纯化挑取pET-28a-hlb阳性克隆，IPTG诱导后收集菌体并超声处理。SDSPAGE电泳结果显示，在相对分子质量约37×103处检测到了重组表达蛋白的条带，与预期大小一致。目的蛋白主要存在于上清中，以可溶性表达为主。进一步利用镍离子螯合柱纯化超声上清，最终得到纯度较高的目的蛋白。
2.1.3 Hlb蛋白对绵羊红细胞溶血活性测定利用PBSB溶液将Hlb蛋白稀释至不同浓度，加等体积的2%绵羊红细胞悬液，37℃孵育1 h后4℃静置1 h。低速离心后取上清，测定其在波长405 nm的光密度值。结果显示，Hlb能显著裂解绵羊红细胞，表明纯化的Hlb具有很好的溶血活性。
2.1.4 Hlb蛋白对不同物种红细胞溶血活性测定将各物种(绵羊、小鼠、家兔、人)新鲜血液样品配制2%的红细胞悬液，以绵羊红细胞为阳性对照，将Hlb蛋白稀释至不同浓度(0，0.5，1.0，2.0，4.0和8.0μg/ml)。将2%的不同种属红细胞悬液与稀释好的Hlb蛋白溶液等体积混合，37℃温育1 h后置于4℃1 h。低速离心后取上清用酶标仪测定其在波长405 nm的光密度值。结果显示，Hlb能显著裂解绵羊红细胞并呈剂量依赖关系。对人和兔红细胞的裂解能力低于绵羊红细胞，而小鼠红细胞对Hlb蛋白的溶血作用并不敏感。
相同浓度Hlb蛋白对不同种属红细胞的裂解程度比较，采用具有一个重复测量的两因素设计定量资料的方差分析，可知红细胞类型、Hlb浓度、红细胞类型与Hlb浓度的交互作用均有统计学意义。绵羊红细胞分别与人、兔、小鼠红细胞比较，在Hlb蛋白浓度为0时，差异无统计学意义，浓度分别为0.25、0.5、1、2、4μg/ml时，差异均具有统计学意义。
2.1.5 Hlb特异多克隆抗体的制备及其中和活性测定利用重组Hlb蛋白免疫大耳白兔，经过2次加强免疫，抗血清效价>1∶60 000。亲和纯化免疫后的兔血清，ELISA结果表明，纯化后抗体能够与Hlb特异结合(图4A)。进一步在Hlb作用于绵羊红细胞的同时，每孔加入0.05μg anti-Hlb，即anti-Hlb与不同浓度Hlb、2%的红细胞悬液等体积混合，37℃温育1 h后4℃静置1 h。低速离心后取上清，检测405 nm波长的光密度值。结果显示，anti-Hlb可有效抑制Hlb的溶血活性。以上结果表明，我们成功制备了具有良好中和活性的Hlb的特异性抗体。
2.2 HlbH-149-N重组蛋白的表达2.2.1 pET-28a-hlbH-149-N表达载体的构建同样以NCTC-8325基因组DNA为模板，利用重叠PCR法扩增hlbH-149-N基因，琼脂糖凝胶电泳图谱检测显示，扩增得到的单一条带与预期大小相符。菌落PCR鉴定结果表明，PCR产物成功连接至pMD-19T载体，经过与上述pET-28a-hlb相同的酶切、回收、连接、转化、鉴定过程，最终成功构建重组表达载体pET-28a-hlbH-149-N。
2.2.2 HlbH-149-N蛋白的表达和纯化挑取pET-28a-hlbH-149-N阳性克隆，IPTG诱导后收集菌体并超声处理。SDS-PAGE电泳结果显示，在相对分子质量约37×103处检测到了重组表达蛋白的条带，与预期大小一致。目的蛋白主要存在于沉淀中，并以包涵体表达形式表达。经变性复性后，进一步利用镍离子螯合柱纯化，最终得到纯度较高的目的蛋白。
2.2.3 HlbH-149-N蛋白对绵羊红细胞溶血活性测定以Hlb为阳性对照，利用PBSB溶液将Hlb蛋白和突变体HlbH-149-N蛋白稀释至不同浓度，加等体积2%的绵羊红细胞悬液，37℃孵育1 h后4℃静置1h。低速离心后取上清，测定其在波长405 nm的光密度值。结果显示，Hlb能显著裂解绵羊红细胞，而突变体HlbH-149-N不能裂解绵羊红细胞，表明HlbH-149-N突变成功。
2.3 Western印迹验证重组蛋白的表达利用15%SDS-PAGE电泳分离重组的Hlb蛋白，而利用亲和纯化的anti-Hlb抗体可特异性检测Hlb、HlbH-149-N蛋白的表达情况。结果显示，成功表达了Hlb、HlbH-149-N蛋白，且目的蛋白与预测蛋白相对分子质量(37×103)一致。
3讨论本研究成功构建了pET-28a-hlb高效可溶性表达载体，获得了纯度较高的重组金葡菌Hlb蛋白，溶血活性检测该蛋白能显著裂解绵羊红细胞。同时我们还检测了Hlb蛋白对不同物种红细胞的作用。结果表明，Hlb蛋白不同种属红细胞裂解作用不同，其中绵羊红细胞作用敏感，这与文献报道相一致[7]。Walev等[12]认为，这与细胞所含鞘磷脂的含量有关。同时我们利用点突变技术，获得了不能裂解绵羊红细胞的HlbH-149-N突变体蛋白。制备并纯化了Hlb蛋白的特异性抗体，溶血活性检测结果表明，Hlb蛋白的特异性抗体anti-Hlb能显著抑制Hlb介导的红细胞裂解作用，表明该抗体具有良好的中和活性。
目前对于金葡菌溶血素的研究大多集中在其毒性和致病机制上，但其具体作用机制尚不明确。国内针对金葡菌溶血素的研究报道较少，溶血素作为一种外毒素并未得到应有的重视。相对而言，国外对于溶血素的专门研究却悄然兴起，最近十几年，溶血素的家族成员、分子结构、分类、作用机制日趋明朗。多种致病菌分泌的溶血素均为重要毒力因子。因此，抵抗细菌毒素对机体细胞的损伤，不失为寻找代替抗生素治疗细菌性疾病的一条新路。本研究利用原核表达系统表达了β-溶血素，并进一步制备了具有中和活性的特异性抗体，为进一步研究其致病的分子机制及其免疫保护作用提供了前期工作基础。
