细胞仪检测癌细胞论文.doc

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细胞仪检测癌细胞论文细胞仪检测癌细胞论文预读:摘要:1、MTS/CCK-8法检测细胞增殖贴壁细胞需待细胞贴壁后,再收集各时间点细胞进行检测.收集各个时间点的细胞(0h、24h、48h、72h)加入CCK-8溶液或cellTi-ter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂(Promega,Cat．No．G3582),比例为1/10.即100μl培养液加入10μl检测液.在孵育4h后,酶标仪读板,MTS检测读取OD490数据,CCK-8检测读取OD450数据.流式细胞仪检测细胞周期:细胞转染后72h后每样收集1×106细胞,细胞固定,离心收集细胞,弃上清,用预冷PBS洗细胞两次,加入预冷70%乙醇,于4℃固定过夜,或-20℃长期固定.细胞染色:离心收集细胞,以1ml的PBS洗细胞一次,加入500μlPBS含50μg/ml溴化丙锭(PI),100μg/mlRNaseA,0．2%TritonX-100,4℃避光孵育30min.流式分析:以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2～3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析.

2、流式细胞仪检测细胞凋亡细胞转染后72h后每样收集1×106细胞,细胞固定:离心收集细胞,弃上清,用预冷PBS洗细胞两次,加入预冷70%乙醇,于4℃固定过夜,或-20℃长期固定.将0．5ml细胞悬液从细胞培养板中(5×105个细胞)转移到一个干净的离心管内.加入1．25μlAnnexinV-FITC.室温(18～24°C)避光反应15min.室温1000r/min离心5min,去除上清.将细胞用0．5ml预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬.加入10μlPropidiumIodide.将样本放置在冰上避光保存.立即用流式细胞仪检测分析.

3、Westernblotting检测CD14蛋白表达:在细胞中加入RNA裂解液提取总蛋白,BCA法定量蛋白.将提取好样品的蛋白进行SDS-PAGE,电泳结束后电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉溶液室温封闭1h.加入合适的一抗稀释浓度4℃温育过夜(CD14按1∶500稀释,GAPDH按1∶1000稀释),加入1∶4000倍稀释的二抗,37℃孵育1h.温育结束后,ECL底物发光法进行曝光.洗涤PVDF膜,剥脱后加入1∶10000内参抗体,4℃温育过夜,曝光成像.Real-timePCR检测TNF-α、IL-8基因表达:收集细胞,用TRIzol法提取各细胞总RNA,采用cDNA第一链合成试剂盒反转录成cDNA.按照引物设计原则设计PCR引物,TNF-α、IL-8的上、下游引物序列如表1所示.

4、统计学分析用SPSS11．5软件进行数据处理与分析.实验数据以x±s表示.One-wayAnalysisofVariance(One-wayANOVA)进行各组间方差分析,方差齐时用LSD法,方差不齐时用Tambane’sT2法,P＜0．05为差异有统计学意义.

5、结果5．1感染细胞最佳MOI的测定MTT法检测慢病毒转染SGC-7901后细胞增殖转染后24h,正常组细胞增殖率为218．18%,阴性对照组为216．27%,CD14shRNA组为211．63%,各组间相比,差异无统计学意义(P＞0．05);转染后48h、72h正常组细胞增殖率为427．49%、479．22%,阴性对照组为417．84%、473．37%,CD14shRNA组为345．54%、362．64%,经比较,CD14沉默后细胞增殖率下降(P＜0．05).流式细胞仪检测慢病毒转染SGC-7901后细胞凋亡CD14shRNA组细胞早期凋亡、晚期凋亡及总凋亡率均高于正常组、阴性对照组,经比较,差异有统计学意义(P＜0．05,见图4).流式细胞仪检测慢病毒转染SGC-7901后细胞周期结果显示,CD14shRNA组细胞G1期42．57%、S期38．65%、G2期13．22%;正常组细胞G1期35．91%、S期52．60%、G2期11．49%;阴性对照组细胞G1期36．78%、S期51．49%、G2期13．67%,经比较,差异有统计学意义(P＜0．05).由此推断,CD14沉默后,主要影响细胞S期,干扰细胞合成.

5．5Westernblotting检测慢病毒载体转染SGC-7901细胞后CD14蛋白表达Westernblotting检测结果显示,在转染胃癌细胞后,CD14shRNA慢病毒载体组细胞CD14蛋白表达相对于正常组及阴性对照组明显减少,从灰度值分析显示看出,CD14shRNA慢病毒组灰度值(0．01)远远小于正常组(1．0)及阴性对照组(0．83),正常组及阴性对照组的灰度值基本相当,由此推断CD14shRNA慢病毒载体转染胃癌细胞SGC7901后使CD14蛋白的表达量降低,同样以WB的灰度值为纵坐标作图也反映了这样的结果(见图5).注:RelRatio:相对比.图5CD14Westernblotting检测Fig5CD14WesternblottingdetectionReal-timePCR检测慢病毒载体转染SGC-7901细胞后TNF-α、IL-8表达结果显示,CD14shRNA转染胃癌细胞后,TNF-α、IL-8mRNA表达较正常组、阴性对照组呈下降趋势,差异有统计学意义(P＜0．05).由此推断,CD14沉默后使TNF-α、IL-8表达下降(见表2).

6讨论我们研究发现CD14沉默后,胃癌细胞增殖率下降,细胞周期阻滞发生在S期,胃癌细胞合成减少,凋亡率增加,CD14/TLR-NF-κB下游炎症因子TNF-α、IL-8合成减少.综上,我们有理由推测CD14基因在胃癌的发生、发展中占据重要地位,CD14/TLR-NF-κB信号通路过度活化,导致炎症级联反应放大,阻断CD14基因表达,将对胃癌防治是有利的,下一步,我们将通过在体实验,观察沉默CD14基因后,对H．pylori感染结合化学诱导法所致胃癌的干预作用.