马传染性贫血病毒LTR关键点突变对DLV致弱机理的研究动物医学论文.doc

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马传染性贫血病毒LTR关键点突变对DLV致弱机理的研究_动物医学论文【中文摘要】马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)可以引起马属动物的一种急性烈性传染病,以贫血、持续感染、反复发热为特征,终生持续感染,是马属动物最重要的传染病之一。EIAV与人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)同属逆转录病毒科、慢病毒属成员,两者在抗原特性、基因组结构等方面极为相似,以及从经济与安全性角度上考虑,EIAV将是研究HIV乃至慢病毒的最理想的动物模型。沈荣显等科学家于20世纪70年代通过体外细胞传代致弱路线研制成功了马传贫驴白细胞弱毒疫苗,是迄今世界上唯一大规模成功应用的慢病毒疫苗,揭示该疫苗的免疫保护机制,可为研究HIV等其它慢病毒疫苗提供有价值的借鉴。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,利用我国马传染性贫血病毒疫苗培育系统(由强毒到弱毒的不同代次病毒),对EIAV弱毒疫苗致弱过程中不同代次EIAV毒株非编码区LTR序列分析,发现病毒致弱的基因变异规律性位点,即LTR R区序列呈现规律性变化:TAR结构起始位置碱基在59代之前多数为A,而64代之后均为G;poly(A)附加位点在45代之后(除55代外)一致表现为AA,提示这些突变引起的位点或结构变化很可能与病毒毒力减弱有直接关系。因此基于EIA代次毒株LTR序列分析结果,选取EIAV基因非编码区LTR R区作为研究对象,以驴胎皮肤弱毒疫苗感染性分子克隆pLGFD3-8为父本操作系统进行基因的定点突变,即LTR R区的TAR结构起始碱基由弱毒株的G变为强毒株特征A,poly(A)附加位点碱基由弱毒株的AA变为强毒株特征CA,形成具有四处点突变型强弱嵌合感染性的分子克隆。构建EIAV非编码区强弱毒嵌合的全基因分子克隆,将阳性重组质粒命名为pLGFD-M。将该嵌合克隆体外转染驴胎皮肤细胞(FDD)并进行FDD传代,通过逆转录酶活性试验、前病毒DNA PCR扩增、RT-PCR方法及实时定量RT-PCR等试验验证其转染结果。结果显示,LTR嵌合克隆衍生病毒感染FDD出现明显的细胞病变,电镜下可见大量典型的EIAV颗粒,将其病毒命名为vpLGFD-M;细胞培养上清可检测到RT酶活性;前病毒DNA PCR扩增和RT-PCR均为阳性。在细胞水平上对该嵌合克隆衍生毒及其亲本感染性分子克隆毒株复制能力进行了检测,发现此嵌合克隆衍生病毒比其父本克隆衍生病毒的复制水平略高些,保持了亲本皮肤弱毒疫苗感染分子克隆的复制特点和细胞嗜性。本研究在分子生物学方面的新发现是——明确了EIAV LTR反转录时,病毒RNA是先由5’LTR的R-U5与3’LTR U3重组形成前病毒基因组一端的长末端重复序列“新”3’LTR,在新形成的3’LTR上的启动子和转录基因的指导下,进行EIAV的复制与蛋白质的合成。本项研究对进一步在分子水平上阐明我国EIAV疫苗株的复制机制和减毒机理具有极其重要的意义,为进一步确定我国马传贫弱毒疫苗株毒力致弱及免疫保护的分子机制奠定了重要的分子生物学基础,并将为其它人和动物慢病毒的免疫预防研究提供试验依据。