胸膜肺炎放线杆菌质粒的序列测定与分析动物医学论文.doc

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胸膜肺炎放线杆菌质粒的序列测定与分析_动物医学论文【中文摘要】胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuroplneumoniae，APP)属于革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧生长。胸膜肺炎放线杆菌可以引起猪的传染性胸膜肺炎，能引起各个年龄的猪发生急性和慢性感染，以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变。随着规模化养殖的发展，近几年来该病的发生呈上升趋势，造成了很大的经济损失。为了解决这一问题，需要从分子生物学水平更深入地开展研究。应用碱裂解方法，对APP2、APP7与APP9三株细菌进行质粒抽提，从APP2与APP9中获得了质粒。我们采用EcoRI限制性酶切，胶回收酶切片断、与同样酶切的载体pBS连接，得到的阳性克隆用M13通用引物双向测序。然后用引物延伸(Primer walking)的方法，测定整个质粒的序列。分析结果显示，APP2菌中含有2个大小不等的质粒，分别命名为pAPP2-7与pAPP2-8，大小分别为4.7kb、9.6kb。说明APP2菌中含有两个相容的质粒pAPP2-7与pAPP2-8。对质粒pAPP2-7和质粒pAPP2-8进行生物信息学分析，包括质粒全序列的G+C含量与重复序列分析；ORF的搜索、ORF的同源性比较、ORF的CDS的功能；以及氨基酸密码子的倾向性分析等。质粒pAPP2-7全长为4722bp，质粒pAPP2-8全长为9569bp，G+C含量分别为31.58％、32.0％。在每个质粒上存在着大小不等的反向重复和正向重复序列，这些重复序列散落分布，遍布整个质粒，可能对质粒的复制起着重要的作用。ORF分析表明，质粒pAPP2-7上存在着三个主要的ORF，分别编码MobA、MobC及Rep蛋白；质粒pAPP2-8上也存在着分别编码Mob-Pre，Rep 3和Transposase 27的3个主要ORF。随后对ORF氨基酸密码子的倾向性进行了分析。为了构建胸膜肺炎放线杆菌-大肠杆菌穿梭质粒载体，对质粒pAPP2-7 ORF之外的序列BlastN比对、分析，推测质粒pAPP2-7的复制子，包括质粒的复制起始蛋白以及其上游的一段序列，大小为2.7Kb；用一对带有EcoRI酶切位点的引物，PCR扩增该片断，与pMD-18 T载体连接，转化大肠杆菌TG1，氨苄平板筛选，挑取阳性克隆，经酶切和PCR鉴定，获得阳性重组子pAPP2-MD。EcoRI限制性酶切质粒pAPP2-MD，回收酶切产物，与同样酶切的带有大肠杆菌复制原点的Kan~r基因连接，连接产物转化大肠杆菌TG1，挑取克隆子，获得阳性重组子pAPK2，转化胸膜肺炎放线杆菌血清7型受体菌，抽提质粒得到pAPK2，表明质粒pAPP2-7改造成功。为进一步从分子生物学水平研究胸膜肺炎放线杆菌提供了技术支持。