暴发性肝衰竭血脑屏障通透性的研究现状_临床医学论文【摘要】为了解血脑屏障通透性改变与暴发性肝衰竭时肝性脑病发生、发展的关系，本文综述了血脑屏障的结构及功能，阐述了血脑屏障是一个细胞复合体，它能维持中枢神经内环境的高度稳定，当发生暴发性肝衰竭时，血脑屏障出现通透性改变，而这种改变又是受脑细胞相关因素影响的。【关键词】肝衰竭；血脑屏障；肝性脑病暴发性肝衰竭（Fulminant Hepatic Failure，FHF）是指发生于既往肝功能正常的患者，短期内出现肝脏功能急剧恶化，出现黄疸后8周内即有进行性意识改变直至昏迷和凝血功能障碍等肝性脑病症状的症候群。该病发生率不高，但是起病急，进展快，因此病死率极高，可达70％左右，是一种严重威胁人类健康的疾病[1]。脑水肿是FHF晚期最常见的严重并发症，不仅可引起患者脑功能障碍，而且可因颅内压升高引发脑疝而死亡。尽管FHF时脑水肿的机制并不十分清楚，但许多研究证实细胞毒性和血管源性机制都参与了FHF时脑水肿的形成[2]。血脑屏障（BloodBrainBarrier,BBB）的破坏在脑水肿的发病机制中发挥着重要作用，一方面因为血脑屏障破坏导致血浆蛋白、水分进入细胞间，使细胞外水分增多引起血管源性脑水肿；另一方面血脑屏障通透性的增高使正常情况下难以通过血脑屏障的许多毒性物质进入脑组织，损害脑细胞引起细胞毒性脑水肿[3]。FHF时机体发生BBB损伤是由多种因素共同作用的结果，但是目前FHF时BBB改变的机制仍不太清楚。本文就近年来关于暴发性肝衰竭时血脑屏障改变方面的研究做一系统综述。1血脑屏障的基本结构血脑屏障是中枢神经系统中重要的解剖结构，是由无窗孔的毛细血管内皮细胞及细胞间紧密连接（Tight Junctions，TJ）、基膜、周细胞、星形胶质细胞足突和极狭小的细胞外隙共同组成的一个细胞复合体，是存在于脑和脊髓内的毛细血管与神经组织之间的一个动态的调节界面。研究认为它不仅可限制血液循环中某些物质进入脑组织，还能选择性地将脑内有害或过剩物质泵出脑外，从而维持中枢神经系统(Central Nervous Svstem，CNS)内环境的高度稳定性，以利于中枢神经系统的机能活动[4]。其中内皮细胞是组成BBB的基本骨架，TJ是BBB最重要的结构。1.1脑毛细血管内皮细胞脑毛细血管内皮细胞与外周血管内皮细胞相比，在形态及结构上有其特殊性：（1）细胞间具有紧密连接；（2）毛细血管内皮细胞外的基底膜是连续的；（3）毛细血管壁外表面积的85%都被神经胶质细胞的终足所包绕；（4）胞膜缺少小孔，胞浆缺少吞饮小泡，细胞的胞饮作用很微弱。这些特殊性决定了血液中的物质不容易通过吞饮方式，穿隧道方式进入CNS[5]。1.2紧密连接早在20世纪60年代，就有研究者将辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）注入血液，通过电子显微镜观察发现，HRP不能透过脑毛细血管的紧密连接。TJ为位于连接复合体最顶端的组成部分，电子显微镜下可以观察到，脑血管内皮细胞间TJ比其他组织中的TJ更复杂，TJ的相邻细胞两层质膜紧紧靠在一起，中间没有空隙，黏着牢固。利用冰冻断裂复型技术发现，TJ象围绕在细胞四周的“焊接线”，相邻细胞细胞膜被焊接线“焊接”在一起，形成了绳索样的连接物。一般认为该连接物是由成串排列的特殊跨膜蛋白组成，相邻细胞的“嵴线”相互交联封闭了细胞之间的空隙。TJ的主要功能是封闭上皮细胞的间隙，保证物质转运的方向性[6]。而且，通过测量TJ通透性最敏感的指标“跨内皮电阻（Transendothelial Electrical Resistance，TER）”，已经测得大鼠脑微血管TJ的TER远远高于其他组织[7]。血脑屏障TJ主要由跨膜蛋白和胞质附着蛋白两种成分组成,细胞骨架(主要是微丝)也是组成TJ的重要组成部分。在TJ的下方存在黏着连接,通过黏着斑连接蛋白为钙黏素的延伸形成跨膜网架。TJ与黏着连接在维持BBB稳定方面共同发挥作用[8]。1.2.1跨膜蛋白三个结构完整的蛋白：Claudins、Occludins和连接黏附分子(junction adherence molecular，JAM)组成TJ的跨膜结构。跨膜蛋白的细胞内部分与胞质附着蛋白相连，细胞外的部分与相邻细胞的跨膜连接蛋白相互作用。1993年，Furuse等[9]分离出第一个TJ跨膜蛋白，称为Occludin。序列分析发现Occludin是一个相对分子质量为65×103的蛋白质，其氨基端和C端均位于细胞内，细胞外部分跨膜4次，形成两个环状结构，每个环由45个氨基酸构成，第一个环状结构主要由甘氨酸和酪氨酸组成，是细胞间形成TJ的主要部位。相邻细胞就是通过外环以拉链状相互结合而产生旁细胞封闭。Occludin直接参与了脑微血管内皮细胞上的TJ形成，它是一个调节蛋白，能改变细胞间的通透性，Occludin可对穿越BBB提供电阻，可能在连接内形成水通道，从而可使不带电荷的溶质流动。Occludin在脑内皮细胞的表达明显高于外周组织，是TJ最敏感和最可靠的标志，其高水平表达及磷酸化被认为是形成血脑屏障高跨内皮电阻的必备条件。2000年Bolda证实[10]：Occludin跨膜区的两个环形结构和胞浆区的C端对调节细胞间的通透性同等重要。Occludin的N端胞浆区调节中性粒细胞跨上皮游走，这个过程不依赖于跨膜电阻TJ和细胞间的通透性。在脑肿瘤组织周围血脑屏障的破坏常伴随Occludin的表达缺失[11]。1998年Furuse等又发现了两个新的完整的TJ跨膜分子：Claudin1、Claudin2[12]。Claudin是一个多基因家族，至今已发现超过24个成员。Claudin是小分子跨膜蛋白，相对分子质量大约20～22×103，跨膜4次，以二聚体的形式存在，Claudin在成纤维细胞上异位表达也能诱导类TJ结构，说明Claudin参与了TJ的形成，但与TJ的器官特异性无关。Claudin种类的组成直接决定BBB的功能[13]。在哺乳动物内皮细胞内，只有Claudin1和Claudin5被证实存在，其中Claudin5主要存在于血管内皮细胞，特别是脑毛细血管内皮细胞。实验证明胶质细胞瘤的患者血脑屏障通透性增高与Claudin5和Claudin1表达减少密切相关，因此提示，对Claudin特别是Claudin5的调节，选择性的改造TJ，为调控BBB通透性提出了一条可能的途径[14]。Claudins和Occludins形成了TJ的细胞外成分，而且是BBB结构的必要成分。在冰冻切片上可见Claudins与Occludins汇成杂聚物，形成膜内链，因此有的学者推测这些链包含水通道，它允许离子和亲水分子选择性扩散[15]。1998年MartinPadura等发现了另一个跨膜蛋白—连接黏附分子(JAM)，属于免疫球蛋白家族成员。包含JAM1、JAM2、JAM3和ESAM，其中JAM1与BBB内皮细胞间TJ相关，JAM1相对分子质量大约40×103，只有一个跨膜区域，其细胞外区域有2个免疫球蛋白样环状结构组成。JAM1可连接ZO1、Cingulin、AF6、MUPP1[16]。JAM1能增加细胞间距，使TJ不能形成。1999年DelMaschio在体内和体外试验中发现，一个敲除了JAM1的抗体能抑制白细胞的渗出[17]。2001年Aurrond发现了在胚胎组织中JAM2有较高表达。2000年Palmeri[18]发现JAM3在大多数的血管内皮细胞有表达。JAM发挥细胞与细胞间的黏附作用并参与TJ渗透性的调控和白细胞迁移的调节。几乎所有上皮、内皮细胞表面均有JAM，JAM高表达的细胞所形成的TJ并不表现出对可溶性示踪剂的扩散阻力增加，说明其功能主要是参与TJ渗透性的调节，并与血小板内皮细胞黏附分子1有关，参与淋巴细胞迁移的调节[19]。1.2.2胞质附着蛋白胞质附着蛋白是TJ支持结构的基础，包括ZO、Cingulin、7H6和其他。属于MAGUK（membraneassociated guanylate kinaselike proteins）家族，ZO有3个限制性区域：1个SH3区，1个GUK区，3个PDZ区(PDZ1、PDZ2、PDZ3)这些区域对信号转导和锚定跨膜蛋白到细胞骨架非常重要。并且在细胞质的蛋白质组装中起主导作用。PDZ区介导特异性结合到跨膜蛋白的C端胞浆尾侧。PDZ区连到Claudin，GUK区连到Occludin。ZO1，ZO2和ZO3的相对分子质量依次为220×103、160×103、130×103。它们的PDZ区与Claudin的C端直接相连。ZO1、ZO2、ZO3的谷氨酸激酶区与Occludin的C端相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一起，并能识别TJ位置及传递各类信号[20]。MUPP1可能和Claudin1和JAM的羧基端相互作用。肌动蛋白连到ZO1和ZO2的C端部分，使连接跨膜成分更为复杂，从而对内皮细胞提供结构支持。其中ZO1在连接跨膜蛋白与细胞骨架蛋白之间起着重要的中心作用，其下游连接细胞内相关信号传导酶类和细胞激动蛋白，如果其水平的下降和活性降低均将影响细胞间紧密连接结构的稳定和细胞功能的完整性。当然，肌动蛋白对细胞的结构和动力学有重要作用。其他缺少PDZ区的蛋白质重新组装成TJ，这类蛋白质就是7H6抗原。相对分子质量为155×103，TJ上的7H6抗原磷酸化蛋白对金属及大分子不通透，而且7H6对TJ的能量状态很敏感。ATP缺乏7H6能可逆的与TJ分离，而细胞间的ZO仍保持连接，细胞间通透性增高。Cingulin相对分子质量为140～160×103，定位于TJ胞浆表面。体外实验研究表明，ZO1、ZO2、ZO3、肌球蛋白和AF6与Cingulin的N端相结合，肌球蛋白和ZO3连到Cinglin的C端。实验表明，Cingulin在TJ胞浆表面起支架的作用，在蛋白板和细胞骨架间形成连接[21]。1.2.3细胞骨架蛋白TJ的完整性依赖肌动蛋白结构组装和功能状态。骨架蛋白将由跨膜蛋白和胞质附着蛋白组成的连接复合物固定在细胞内，维持TJ的稳定[22]。1.3星形胶质细胞脑血管超微结构的研究表明，星形胶质细胞环血管现象是脑内独有的，大量研究表明，星形胶质细胞对内皮细胞有极大的影响，对BBB维持具有重要作用。Janzer和Raft[23]用经典实验揭示了星形胶质细胞在BBB完整性诱导方面的作用。他们用鼠胚胎脑中的星形胶质细胞分离后移植入鼠的眼前房中，结果虹膜中无BBB特性的毛细血管表达了BBB的特性，而用脑膜细胞移植，则不具有此变化。原代培养的脑微血管内皮细胞若不同星形胶质细胞共同培养，很快就会失去BBB的特性。其机制目前尚不十分清楚，可能与星形胶质细胞可分泌活性物质，作用于内皮细胞有关[24]。另外，星形胶质细胞可摄取细胞外液的兴奋性氨基酸，从而减轻神经细胞损害。1.4其他结构基膜主要由Ⅳ型胶原，层连蛋白，内激动蛋白，纤维连接蛋白等构成，对周围细胞的分化有一定调节作用，也是除血管内皮细胞和TJ外的第二道屏障[25]。除基膜外，外周细胞及小胶质细胞对BBB也有一定的影响，但对它们的研究还较少，还不明确它们具体的功能。2物质通过血脑屏障的方式物质可以通过扩散(diffusion)或载体转运(mediated transport)的方式由血液进入脑组织，脑组织进入血液。以扩散方式通过血脑屏障的物质最主要的是水和气体，水可以根据血浆渗透压的改变而自由进出脑组织。O2、CO2、N2O、NH3等气体以及挥发性麻醉剂亦可迅速扩散进入脑组织。脂溶性物质及脂溶剂容易透过亲脂性的质膜，因而也能迅速扩散入脑，已知扩散最快的物质是乙醇。葡萄糖、氨基酸和各种离子是靠载体转运的。各种氨基酸进入脑组织的快慢不同，这与有无相应的氨基酸载体以及载体的量与质(特异性)有关。引人注目的是凡营养上必需的氨基酸大都转运迅速，而难以越过血脑屏障的都是非必需氨基酸。各种离子的转运快慢也不同，但都比进出其他组织的速度慢得多。可扩散入脑的物质一旦解离形成离子则越过血脑屏障的速度减慢，例如NH3、水杨酸(未解离者)、CO2分别较NH+4、水杨酸根、HCO-3进入脑组织快。H+的转运也很慢，与CO2的迅速扩散呈鲜明对比。脑毛细血管内皮细胞具有丰富的线粒体，使某些物质在通过脑毛细血管内皮细胞时受到胞浆内酶系统的作用而被破坏，所以即使能进入毛细血管内皮细胞的物质也不一定都能通过血脑屏障而进入脑实质。现已发现脑毛细血管内皮细胞含有单胺氧化酶(MAO)可使属于单胺类的神经递质(如儿茶酚胺，5羟色胺等)氧化分解，又γ氨基丁酸(GABA)虽然可被脑毛细血管内皮细胞摄入，但却又遭受细胞内GABA转氨酶的作用而被破坏[26]。脑毛细血管内皮细胞还具有一种跨膜蛋白P糖蛋白，它能将已进入脑毛细血管内皮细胞内的某些物质“泵”出细胞外，在药物转运中发挥重要作用。3暴发性肝衰竭时血脑屏障的变化自从Livingstone等首次报道了在实验性急性肝衰竭动物模型中存在BBB损害以来，许多学者纷纷针对此进行了深入的研究[27]。主要集中在两个方面：一方面是关于血脑屏障形态学的研究；一方面是检测血脑屏障对不同物质通透性的改变。Kato M对9名因暴发性肝衰竭脑水肿死亡的患者进行了尸检，发现电镜下脑微血管内皮细胞肿胀，形成大量囊泡空泡，且其中含有电子致密物。基膜增厚，空泡形成，外膜细胞囊泡空泡增加，星形胶质细胞足突肿胀[28]。大部分病人细胞间紧密连接完整，两例病人紧密连接有轻微的增宽。并进一步在去血管所致的大鼠暴发性肝衰竭模型中，观察到BBB形胶质细胞足突肿胀，细胞外间隙增宽[29]。但对过氧化物酶等大分子通透性正常，对菊粉等小分子的通透性增加，在细胞内的囊泡、空泡及线粒体中发现了标记的菊粉。Traber PG在兔急性肝衰竭模型中观察到星形胶质细胞足突肿胀，但毛细血管内皮细胞及细胞间紧密连接正常，且过氧化物酶不能通过血液进入脑组织，提示BBB对大分子物质的屏障功能正常[30]。许瑞玲等通过硫代乙酰胺所致暴发性肝衰竭大鼠模型发现，Ⅰ～Ⅲ度肝性脑病时即有BBB损伤，至Ⅲ～Ⅳ时损伤最明显，并伴有重度脑水肿[31]。以上研究提示在暴发性肝衰竭时血脑屏障结构上没有严重的破坏，但存在着细胞水肿，细胞间缝隙增宽等变化。实验证实BBB通透性的改变主要是通过内皮细胞的损伤，紧密连接的开放，小泡转运的增强，星形胶质细胞的肿胀来实现的[32～35]。FHF时机体发生BBB损伤是由多种因素共同作用的结果。目前暴发性肝衰竭时血脑屏障通透性增高的机制尚不太清楚，但认为与暴发性肝衰竭时产生的多种毒性产物如氨、内毒素和一些细胞因子如TNFα等有关[36]。4影响血脑屏障的因素BBB的通透性变化受脑细胞相关的因素影响。许多调节因子可通过对内皮细胞的转运系统和酶系统进行影响，改变血脑屏障的通透性[37]。在血脑屏障完整的情况下，大脑组织总量依靠渗透压的压力梯度来维持。一旦BBB遭受破坏，则水分就在渗透压压力梯度的作用下穿过受损的BBB进入脑内[38]。4.1自由基的影响自由基通过激活蛋白酶、磷脂酶引起细胞膜和毛细血管的脂质过氧化，从而破坏BBB的完整。人体内存在的一系列天然抗氧化剂和防御氧毒性的酶系统被破坏是血管通透性增加的重要原因[39]。4.2血管活性物质的影响血管活性物质包括缓激肽、组胺、5羟色胺、花生四烯酸和去甲肾上腺素等。Schilling等提出了介导脑水肿的血管活性物质的5条标准：（1）在生理条件下具有调节BBB通透性作用；（2）具有扩张血管作用；（3）可介导血管性脑水肿形成；（4）病理条件组织液及间质液中浓度增加；（5）给予自身抗体可使脑水肿减轻。只有缓激肽完全满足上述条件。组胺、5羟色胺、花生四烯酸和去甲肾上腺素等也可考虑作为脑水肿的介质，但它们的证据明显不如缓激肽清楚[40]。缓激肽的血管活性作用是由内皮细胞腔外面的β2受体所介导的。这些内源性活性物质与血脑屏障关系的研究尚待进一步深入。4.3细胞因子的影响FHF时常伴有内毒素血症，内毒素可以刺激产生多种细胞因子，如IL1、IL6、TNFα等，其中内毒素是诱生TNFα的最强刺激因子，TNFα的增高程度与血中内毒素水平呈明显正相关。大量国内外研究均证实FHF时TNFα水平异常增高，并与肝损伤程度相关；应用TNFα抗体或抑制其生成的药物可以阻断FHF的发生[41]。TNFα参与了暴发性肝衰竭时的多种病理过程，包括发热，肝、肾损害以及脑水肿。早期的研究显示，中枢神经系统注入TNFα能引起剂量依赖性的BBB通透性增加[42]，应用TNFα抗体可阻止血脑屏障开放及细菌进入[43]，这些均提示TNFα是控制血脑屏障开放的一个重要因素。目前，多数研究证实TNFα能够增加血脑屏障的通透性。braham等给新生猪颈动脉注射TNFα可以导致BBB对大分子物质伊文思蓝(Even’s blue，EB)和小分子物质荧光素钠的通透性增高。Duchini在实验中发现，TNFα能增加BBB对液体相物质的转运，并能增加氨的扩散，对跨细胞作用亦增强，但对吸收介导的胞饮作用无影响，并在实验中观察到TJ的破坏[44]。TNFα与内皮细胞膜上相应的受体结合，可以改变内皮细胞骨架蛋白的结构与功能，使内皮细胞收缩，变圆，增大细胞间隙，导致血管通透性增加。TNFα是全身炎症反应的起始因子，是激活细胞因子级联反应的主要介质，在循环血液中出现最早，并迅速达到高峰，TNFα一旦释放很快引起次级因子IL1、IL6、IL8的大量产生[45]。4.4 AQP4的影响Aquaporin 4(AQP4)是水通道蛋白膜的一种[46]，广泛分布在中枢神经系统的胶质细胞和室管膜上皮细胞，尤其集中于星形细胞的足突。Ke发现，在局灶性的脑损伤中，AQP4表达增加导致屏障损伤，形成血管性脑水肿。相反，如果血脑屏障未损伤，导致的细胞毒性脑水肿中并未发现AQP4表达增加[47～48]。AQP4的升高与血脑屏障的破坏相关，具有促进脑水肿的作用。综上所述，FHF时BBB结构和功能的改变与脑水肿及暴发性肝衰竭时肝性脑病的发生和发展密切相关。由于BBB特殊的结构和功能，对其参与FHF机制的进一步研究将有助于深入探讨FHF的病理过程，从而为优化临床治疗方案提供理论依据。【参考文献】[1]Detry O,De Roover A,Honore P,et al..Brain edema and intracranial hypertension in fulminant failure:pathophysiology and management[J].World J Gastroenterol,2006,12(46):7405-7412.[2]Toftengi F,Larsen FS.Management of patients with fulminant hepatic failure and brain edema[J].Metab Brain 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