汉、回、蒙古族MBL 基因Exon I 54位密码子点突变频率及血浆含量相关性研究临床医学论文.doc

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汉、回、蒙古族MBL基因Exon I 54位密码子点突变频率及血浆含量相关性研究_临床医学论文作者：李萍韩瑞程建君贾天军张庶民【摘要】目的：初步调查我国北方地区汉、回、蒙古族健康人群MBL基因ExonⅠ54位密码子点突变的情况,检测其血浆MBL含量，探讨二者的相关性。方法：用PCRRFLP检测MBL基因点突变频率；用MBL Oligomer ELISA试剂盒测定血浆MBL含量。结果：健康汉族人该基因突变频率0.23，血浆MBL含量均值1.99±1.50mg/L，二者负相关（r=-0.62）；回族人突变频率0.15，MBL含量均值3.40±2.55mg/L，二者负相关（r=-0.67）；蒙古族人基因突变频率0.18，含量均值2.52±1.95mg/L，二者负相关（r=-0.64）。结论：健康汉、回、蒙古族人MBL基因54位密码子点突变频率与其血浆含量均呈负相关。【关键词】汉族；回族；蒙古族；基因顺序【ABSTRACT】Objective:To study and analyze the point mutation at code 54 in healthy North Han,Hui and Mongolia people,measure the plasma levels of MBL,and analyze the association between gene mutation frquencies and plasma MBL concentrations.Methods:PCRRFLP was used to detect MBL point mutation；The MBL plasma concentrations were measured by MBLOliger ELISA kit.Results:Frequencies of point mutation at code 54 of MBL coding gene in healthy Han,Hui and Mongolia people were 0.23,0.15,0.18.The plasma MBL concentrations were 1.99±1.50mg/L,3.40±2.55mg/L and 2.52±1.95mg/L.There was negtive correlation between MBL concentrations and gene mutation frequencies in Han,Huis and Mongolia people(r=-0.62,r=-0.67,r=-0.64).Conclusion:The relationship between mutation frequency at code 54 of MBL gene and the plasma MBL concentrations in North Han,Huis and Mongolia people is negative correlation.【KEY WORDS】Han race,Hui race,Mongolia,Gene order甘露聚糖结合凝集素（mannose binding lectin,MBL）是一种血清C型凝集素，通过糖基识别区选择识别病原生物，如细菌、病毒、寄生虫以及一些恶性肿瘤细胞等膜上特有的糖类结构，起调理素作用，还可通过MBL途径激活补体，在免疫监视和免疫防御中具有非常重要意义[1]。近年来的研究表明，MBL的基因突变频率极高，是血浆MBL水平低下的根本原因，而MBL缺损可引起机体调理吞噬功能低下，从而导致各种病原体反复感染、自身免疫性疾病、反复流产等多种疾病[2],因而引起国内外学者的极大关注。本研究用PCRRFLP方法测定北方健康汉、回、蒙古族人MBL基因Exon I 54位密码子点突变的情况，同时用ELISA方法测定血浆MBL含量，并对突变频率与其血浆含量相关性进行分析。1材料与方法1.1主要仪器基因扩增梯度PCR仪（Eppendorf德国）；凝胶图像分析系统（黑马，珠海）；低温冰柜（三洋，日本）；低温高速离心机（Hearus，德国）；分析天平（GR202,日本）；酶标仪（StatFax2100,美国）；紫外可见分光光度计（756MC,上海）；超净工作台（SWCJ1F,苏州）；稳压稳流电泳仪（DYYⅢ4型,北京）；电热恒温震荡水槽（DKZ2型,上海）。1.2主要试剂MBL Oligomer ELISA试剂盒（Antibodyshop,丹麦）；TaqDNA聚合酶（MBI）；dNTP（Promega）；限制性内切酶BanI（Promega）。1.3标本收集与处理汉族56例标本来自河北张家口市中心血站；回族82例标本来自河北张家口康保地区回族人；蒙古族37例标本来自内蒙古自治区集宁市中旗旗医院。经体检均为健康人群。1.3.1收集静脉血标本EDTANa2抗凝，分离血浆，-86℃保存，供测定MBL含量，含有单个核细胞的下层成分用盐酸胍法提取DNA。1.3.2 MBL Exon I基因54位密码子点突变检测，参照文献[3,4]。根据酶切结果，针对性地选择完全切割、不完全切割和未切割的PCR扩增产物进行序列分析，测序由大连宝生物公司完成。1.3.3用MBL Oligomer ELISA试剂盒对健康汉、回、蒙古族标本血浆MBL含量进行测定。2结果2.1 MBL Exon I基因54位密码子点突变情况：PCR扩增产物酶切显示3种情况：（1）出现232bp和93bp两条带；（2）只显示1条带约325bp，（3）显示325bp、232bp和93bp3条带（图1）。酶切结果与PCR扩增产物的测序结果（图2）一致。证明所扩增产物为MBL基因Exon I的特异靶序列。图1 MBL基因外显子I的PCR产物的Ban I酶切鉴定泳道3:PCR marker:2 000,1 000,750,500,250,100bp(从上到下)；泳道1和7:不被酶切的PCR产物；泳道5:野生型GAC/GAC；泳道4:突变杂合子型GGC/GAC；泳道2和6:突变纯合子型GGC/GGC。图2部分不同基因型的MBL基因PCR产物的测序A、B:GAC/GAC突变纯合子（A：上游，B：下游）；C、D:GGC/GAC突变杂合子（C：上游，D：下游）2.2不同民族汉、回、蒙古族标本测定结果2.2.1 56例汉族标本，野生型（GGC/GGC）33例，突变杂合子型（GGC/GAC）20例，突变纯合子型（GAC/GAC）3例；基因频率0.77（GGC）和0.23（GAC）。血浆MBL含量与突变频率相关性：血浆MBL含量为0～4.948mg/L。含量低于0.1mg/L 3例，突变频率1.00；介于0.1～1mg/L 21例，突变频率0.4524；高于1mg/L 32例，突变频率0.0156。经等级资料的相关分析，χ2=48.107，P<0.001;r=-0.62，二者负相关。2.2.2 82例回族标本，野生型60例，突变杂合型20例，突变纯合子型2例，基因突变频率0.15（GAC）。血浆MBL含量与突变频率相关性：MBL含量0～8.398mg/L。低于0.1mg/L 2例，突变频率1.00；介于0.1～1mg/L 23例，突变频率0.4348；高于1mg/L 57例，突变频率0。经等级资料的相关分析，χ2=73.52，P<0.001;r=-0.67，二者负相关。2.2.3 37例蒙古族标本，野生型25例，突变杂合型11例，突变纯合子型12例，基因突变频率0.18（GAC）。血浆MBL含量与点突变频率相关性：MBL含量0～6.358mg/L。低于0.1mg/L 1例，突变频率1.00；介于0.1～1mg/L 12例，突变频率0.4583；高于1mg/L 24例，突变频率0。经等级资料的相关分析，χ2=32.86，P<0.001;r=-0.64，二者负相关。3讨论MBL通过调理吞噬作用和/或通过结合MBL相关的丝氨酸蛋白酶（MASPs）进一步激活补体而导致其结构破坏，在机体固有免疫应答方面发挥重要作用[1,5]。大多数研究显示，血清MBL低水平或缺失会增加感染性疾病的易感性和感染的严重性,这与MBL在宿主防御方面发挥着重要作用有关。血清中MBL的水平主要由MBL编码基因结构决定，并受启动子区域基因的活性调节。研究已经发现在5′启动子区域有6个突变位点,在Exon I有3个突变位点[6，7]。其中Exon I中54位（GGC→GAC，Gly→Asp，命名为等位基因B）密码子突变会干扰MBL多肽进一步组装成功能性多聚体，进而降低血浆中功能性MBL的含量，且在不同的种族中普遍存在，但不同人种的基因突变频率有所不同。本研究应用PCRRFLP检测MBL Exon I基因54位密码子点突变情况，并对部分扩增产物进行了序列分析。通过用Ban I酶对扩增产物进行酶切分析来判定结果，当产物酶切电泳图谱为两条带时，进行双向测序，结果显示54位密码子分别为GGC和GCC；当呈现一条带时，54位密码子分别为GAC和GTC；当呈现3条带时，54位密码子分别为GG（A）C和GC(T)C,测序图显示套峰；酶切结果与测序结果相一致。健康汉、回、蒙古族结果比较，回族人血浆MBL含量高于蒙古族（q=1.276，P＞0.05）；蒙古族人血浆MBL含量高于汉族（q=3.91，P<0.01）；经方差分析，F=7.89，P<0.01。基因突变频率比较：经χ2检验，χ2汉、蒙=0.8649，P＞0.05；χ2汉、回=4.0321，P<0.05；χ2蒙、回=0.5942，P＞0.05。χ2总=3.31，P＞0.05。以上结果显示：（1）血浆MBL含量低于0.1mg/L时，全部为纯合子基因突变者；含量高于1mg/L，大部分(汉族：96.88%；回族：100%；蒙古族：100%)为未突变野生型；介于0.1～1mg/L之间，大部分（汉族：90.48%；回族：86.96%；蒙古族：91.67%）为基因突变杂合子，余下小比例的标本用Ban I酶切的电泳结果显示不突变，这有可能是其它位点的突变而导致血浆MBL含量降低所致。（2）三民族血浆MBL含量比较回族人含量高于蒙古族，但无显著性差异；蒙古族人含量高于汉族人且差异显著。三民族基因突变频率比较回族人低于蒙古族，但无显著性差异；蒙古族低于汉族也无显著性差异，但汉、回族基因突变频率比较有显著性差异。以上汉、回、蒙不同民族结果与文献[2]报道符合，文献中指出MBL的基因型是一个比较合理的衡量群体血浆MBL浓度的预报因子，我们所测得结果中健康回族人血浆MBL含量最高，基因突变频率最低，从上述数据表明MBL基因Exon I54位密码子的突变会明显影响其血浆中MBL的含量。本研究为进一步探讨中国人MBL基因突变情况与血浆MBL水平及二者的相互关系提供了实验依据，为我们进一步深入研究MBL与临床多种疾病的相关性奠定了一定的基础。【参考文献】1李萍，贾天军.甘露糖结合凝集素研究进展[J].中国医学检验杂志，2004,5（2）：7578 2 Kilpatrick DC.Mannanbinding lectin:clinical significance and applications[J].Biochim Biophys Acta,2002,1572:401413 3贾天军，李萍，张庶民，等.蒙古族人MBL基因Exon I 54位密码子点突变频率与其血浆含量的相关性[J].细胞与分子免疫学杂志,2004,20（3）:261264 4贾天军，李萍.MBL Exon I 54位基因突变检测方法的建立及初步应用[J].中国生物制品学杂志,2003,16（6）:327329 5贾天军，李萍，张庶民.MASPs的结构与功能研究现状.医学综述,2003,9(4):193195 6 Juliger S,Kremsner PG,Alpers MP,et al.Restricted polymorphisms of the mannosebinding lectin gene in a population of Papua New Guinea[J].Mutat Res,2002,505:8791 7 Worthley DL，Bardy PG，Mullighan CG.Mannosebinding lectin:biology and clinical implication[J].Inten Med J,2005,35:548555。