基因改造中快速PCR定点突变方法应用医学论文.doc

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基因改造中快速PCR定点突变方法应用_医学论文【关键词】铜锌超氧化物歧化酶铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)因为可以消除O-・2而被广泛应用于延缓衰老和控制炎症，但是由于多种因素影响，尤其是Cu，Zn-SOD具有种质特异性以及在体内停留时间短(通常只有6～10min)，使得Cu，Zn-SOD的应用受到很大限制。定点突变技术是改造、优化基因常用的手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有效方法，在医学上还可用于基因治疗等。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸PCR定点突变及盒式突变等〔1〕。但由于这些方法操作繁琐，意外突变多等缺陷，使定点突变的实验受到一定限制。本研究采用一种近年来新的定点突变技术―快速PCR定点突变方法成功地对hCu，Zn-SOD进行了基因改良(将hCu，Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码子，以提高其稳定性)，同时对该定点突变技术要点进行探讨。1材料11菌株与质粒E.coli DH5α，由本实验室保存。质粒pESOD(含hCu，Zn-SOD基因、Ampr基因以及EcoRI酶切位点，整个质粒约33kb)由本实验室构建，并转化于E.coli DH5α保存。12主要试剂Pfu高保真DNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI酶(河南华美生物工程有限公司);小量质粒快速抽提纯化试剂盒(上海博亚生物技术有限公司);DNA Marker,T4DNA连接酶，Eco RI等常规酶(上海Sangon公司)。13 pESOD质粒提取及鉴定用质粒快速抽提纯化试剂盒从含pESOD质粒的E.coli DH5α转化菌里提取pESOD质粒，取部分质粒用EcoRI酶切后琼脂糖电泳鉴定，另取部分质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。14定点突变141引物设计根据hCu，Zn-SOD基因序列和定点突变的要求(将hCu，Zn-SOD中第111位Cys的密码子TGC突变为Ala密码子GCC)设计出一对包含突变位点的引物(正、反向)P1和P2,具体序列如下：P1：5′CTCTCAGGAGACCATGCCATCATTGGCCGCAC 3′；P2：5′GTGCGGCCAATGATGGCATGGTCTCCTGAGAG 3′。下划线的碱基为突变位置。所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。142 PCR定点突变整个反应体系为50μl，其中含无菌去离子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、P2引物各1μl，pESOD质粒1μl(约100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，65℃30s，72℃延伸7min，25个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。143转化用Dpn I限制性内切酶处理PCR反应产物，直接转化感受态的E.coli DH5α，涂布培养后随机挑3个菌落并提取相应质粒，由上海博亚生物技术育限公司测序，测序引物P3：5′ACTCAGGTACTGGGAGTG 3′。2结果21提取的质粒经EcoRI酶切后琼脂糖电泳质粒大小为3300bp左右，证明所提取的质粒就是pESOD质粒，见图1。1：EcoRI酶切后的pESOD质粒;2：Marker图1 pESOD质粒经EeoRI酶切后琼脂糖电泳（略）22 PESOD质粒测序的部分结果所测序列与文献〔2〕报道的hCu,Zn-SOD序列对比完全一致，证明pESOD质粒内含的hCu,Zn-SOD基因完全正确。23定点突变后3个质粒测序结果及突变前后序列对比(图2)3个质粒的测序结果有2种，分别和文献〔2〕的hCu，Zn-SOD序列对比：其中1个质粒测序结果和hCu,Zn-SOD基因序列完全一致，说明突变未成功；另外2个质粒分别有2个碱基和hfu,Zn-SOD因序列不同，也就是Cys的密码子TGC变成了Ala的密码子GCC，其他序列与hCu，Zn-SOD基因一致，符合预期要求；图2中没有短线条相连的部分为突变前后2序列的不同之处。A：突变后的hCu,Zn-SOD基因序列；B：hCu,Zn-SOD基因序列图2 hCu,Zn-SOD基因突变前后部分序列对比（略）3讨论通过快速PCR定点突变，本研究实现了把hCu,Zn-SOD基因中的Cys111突变为Ala111。整个突变过程只需要1次PCR反应、1次DpnI酶解和1次转化，即完成了定点突变，无需对PCR产物进行末端处理，也无需进行亚克隆等，大大减少了传统定点突变的工作量，而突变成功率较高(本次实验随机挑取的3个菌落中有2个是阳性突变菌落)，尤其适用于大肠埃希菌来源的DNA。快速PCR定点突变的技术要点：(1)准备突变的质粒必须是甲基化。(2)引物是一对包含突变位点的互补的(正、反向)核苷酸链，而且要比一般的PCR引物(18bp～21bp)长，一般要在25bp以上，因为引物中含有突变位点，和模板不能完全匹配。(3)须要高保真的DNA聚合酶如Pfu Turbo聚合酶。(4)PCR产物要用DpnI酶充分酶切消化，以提高突变检出率。(5)PCR延伸步骤时间要充足；因为Pfu DNA聚合酶扩增速率为05kb／min，比Taq酶慢1倍左右。(6)高保真Pfu DNA聚合酶酶量要比普通PCR所需的Taq酶多一些；因Pfu DNA聚合酶不但扩增速率较慢，而且一步法PCR定点突变扩增的是整个质粒，故所需的总时间比一般的PCR时间要长很多，适当增加酶量以补充长时间高温下的酶活力损失。(7)克隆子最后需经测序验证；高保真不等于100％保真。本研究挑选测序的3个菌落中有1个是未突变的阴性菌落，故后续的测序步骤不能省略。参考文献〔1〕罗师平，冷希岗.基于PCR的体外诱变技术［J］.国外医学生物医学工程分册，2005,28(3):188-192.〔2〕Sherman L,Dafni N,Lieman-Hurwitz,et al.Nucleotide sequence and expressionof human chromosome 21-encoded superoxide dismutase mRNA［J］.PNAS,1983,80(18):5465-5469.