细说脂多糖诱导血管内皮细胞的影响.doc

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细说脂多糖诱导血管内皮细胞的影响=“news_bd”>血管内皮功能紊乱(vascularendothelialdys-function，VED)与心血管疾病、糖尿病等各种常见病、多发病关系密切，尤其是感染所引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)、感染性休克、多器官功能障碍综合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)等严重疾患也与VED有关。革兰阴性菌外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)也称为内毒素，是其致病的主要物质成分，可以引起血管内皮功能的异常，如细胞间黏附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)等表达增高，而这种效应是通过核转录因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)细胞信号通路所起的作用。近年来，中药虎杖中的白藜芦醇衍生物反式3，5，4′-三甲氧基二苯乙烯(trans-3，5，4′-trimethoxystilbene，TMS)的抗炎、抗肿瘤等功效引起广泛关注，但其对血管内皮功能的保护和机制问题鲜见报道。本研究拟观察TMS对LPS诱导人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEs)表达NO、ICAM-1及NF-κB蛋白的影响，旨在为临床治疗VED相关疾病提供实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞HUVEs购于中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。1.1.2主要试剂与仪器改良型HamsF-12Medium培养基、胎牛血清购于美国ATCC公司。二甲基亚砜、NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(ammonium pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)、LPS和NO检测试剂盒均购于美国Sigma-Aldrich公司。TMS购于美国Biomol公司。ICAM-1、NF-κBp65、IκBα兔单克隆抗体购于英国Abcam公司，TRIzoL试剂购于美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒和SYBRGreen荧光定量试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，Real-timePCR引物由TaKa-Ra公司设计合成。RIPA、PMSF、BCA-100蛋白定量试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，核蛋白提取试剂盒购于上海贝博生物有限公司，TritonX-100购于美国Amresco公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、FITC标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。数控层析冷柜SL-III(上海新诺公司);荧光分光光度计(天津拓普公司);EC250电泳仪(美国EC公司)，细胞超声粉碎仪VCX105(美国BIO-RAD公司)。全自动凝胶成像分析系统(美国Syngene公司);倒置相差显微镜、荧光倒置显微镜IX70(日本Olympus公司)等。1.2方法1.2.1CCK-8法检测TMS对HUVEs的细胞毒性将HUVEs以1×104/孔接种于96孔板中，当细胞融合度达到60%时进行TMS的干预(终浓度分别为0、5、10、20、50、100μmol/L)，每组设12个复孔。分别于第1、4、8、12、24、48h后根据试剂盒说明书行CCK-8检测，计算细胞存活率，实验重复3次，取其均值，绘制细胞存活率曲线。1.2.2细胞处理及实验分组细胞经复苏后生长融合度达培养板/孔85%时，应用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化，1∶3比例传代，以1×105个/mL的密度接种于6孔板或1×106个/mL接种于25cm2细胞培养瓶中培养，P3～P6代细胞进行后续实验。细胞分为以下6组：①正常对照组(CON组)：以HamsF-12培养基培养细胞12h;②LPS组：HUVEs与终浓度为0.1μg/mL的LPS共孵育12h;③TMS+LPS组：以终浓度为5、10、20μmol/L(分别定义为低、中、高浓度TMS+LPS组)的TMS预处理细胞4h后，再与终浓度为0.1μg/mL的LPS共孵育8h;④PDTC+LPS组：以终浓度为10μmol/L的PDTC预处理细胞4h后，再与终浓度为0.1μg/mL的LPS共孵育8h。细胞置于37℃的5%CO2培养箱中孵育。1.2.3Griess法检测细胞产生的NO浓度以细胞培养上清液中NO2-含量间接反映细胞产生的NO水平变化，收集各组干预后的细胞上清液，于4℃、5000rpm离心5min后取上清液。按照试剂盒说明书进行药品配制并检测，实验重复3次，取均值。1.2.4Real-timePCR检测各组的ICAM-1、NF-κBp65mRNA表达细胞总RNA的提取按照Invitro-gen公司的TRIzolReagent使用说明书进行操作，然后进行总RNA的纯度测定和质量检测，制备反转录cDNA按照TaKaRa公司PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser说明书操作进行。利用Eppen-dorf公司的Realplex实时定量PCR仪进行分析，GAPDH作内参对每个基因进行标准化，每个样品同一个基因重复3次。反应完成后，计算目的基因的相对表达量，用2-△△Ct表示。1.2.5Westernblotting检测各组的ICAM-1、NF-κBp65、IκBα蛋白表达胞浆/胞核蛋白提取按照核蛋白提取试剂盒说明书操作，采用BCA法进行蛋白定量，将蛋白样品在Gel凝胶中电泳，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，分别加入ICAM-1(1∶1000)、IκBα(1∶1000)、NF-κBp65(1∶1000)一抗过夜;TBST洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3000)室温孵育2h。ECL法显色，GIS凝胶图像系统分析，每个样本重复3次，计算各个样本积分光密度(条带强度×条带面积)，分别与β-actin(胞质)、Histone(胞核)为内参做对照的比值(相对IOD值)，以表示目的蛋白的相对表达量，从而反映各目的蛋白水平的变化。1.2.6免疫细胞化学染色检测各组的ICAM-1和NF-κBp65蛋白表达各组细胞经LPS、TMS及PDTC处理后(其中LPS预处理1h后检测NF-κBp65蛋白)，应用一抗ICAM-1(1∶200)、NF-κBp65(1∶100))进行目的蛋白检测，从而反映出各组阳性细胞表达情况。1.3统计学处理利用SPSS18.0统计软件，数据均以珋x±s表示，TMS对细胞存活率的影响采用二因素析因设计方差分析，若同一因素多个水平总体有统计学差异，以SNK法行两两比较;NO表达及ICAM-1、NF-κBp65、IκBα表达采用单因素方差分析，若组间总体差异有统计学意义，以SLD-t检验行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同浓度TMS对HUVEs存活率的影响TMS浓度对细胞存活率有影响(F=8.24，P=0.009)，干预时间对细胞存活率亦有影响(F=69.73，P=0.002)，且二者之间存在交互作用(F=3.65，P=0.025)。与0μmol/L相比，其他各浓度TMS细胞存活率差异均有统计学意义(P<0.01)，其中5、10μmol/L浓度与50、100μmol/L浓度中细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05);20μmol/L__浓度与其他各浓度细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05)。2.2各组NO表达结果与CON组相比，其他各组NO表达量增加(P<0.01);与LPS组相比，低、中、高浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组的NO表达量降低(P<0.05);与低浓度TMS+LPS组相比，中、高浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组的NO表达量降低(P<0.05)。2.3各组表达ICAM-1、NF-κBp65mRNA结果与CON组比较，其他各组ICAM-1mRNA表达均显著增高(P<0.01);与LPS组相比，中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组ICAM-1mRNA表达下降(P<0.05)。NF-κBp65mRNA在各组间的相对表达情况与ICAM-1mRNA表达情况类似。2.4各组ICAM-1、NF-κBp65、IκBα蛋白表达结果CON组HUVEs细胞的胞质中有一定量ICAM-1蛋白的表达，LPS组胞质中ICAM-1蛋白表达量显著增高(P<0.01)。与LPS组相比，中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组胞质中ICAM-1蛋白表达量均降低(P均<0.05)。NF-κBp65蛋白在CON组细胞核中无表达，在LPS组中表达显著增高(P<0.01)，在中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组细胞核中表达降低(P均<0.05)。IκBα蛋白在CON组细胞质中有一定量表达，LPSTMS+LPS组和PDTC+LPS组的表达低于CON组(P均<0.05)。2.5各组ICAM-1和NF-κBp65蛋白细胞免疫荧光结果ICAM-1蛋白荧光检测显示，CON组胞质中有弱ICAM-1蛋白荧光表达，LPS组胞质中有ICAM-1蛋白强荧光表达，而中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组胞质中ICAM-1荧光表达均较LPS组减弱。NF-κBp65蛋白荧光检测显示，CON组中为单纯细胞核染色且无目的蛋白荧光表达，LPS组中有明显的细胞核绿色荧光且为强表达;中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组中NF-κBp65蛋白荧光表达相对LPS组均减弱，且无细胞核荧光表达。3讨论白藜芦醇衍生物TMS分子式为C17H18O3，是以白藜芦醇(Resveratrol，RSV)为模板合成的系列化合物之一。与RSV相比，TMS结构更稳定，3个甲基基团使其更具有亲脂性，易于和细胞膜结合，从而更容易透过细胞膜发挥药理作用。TMS活性广泛，具有抗有丝分裂、抗新生血管、抗肿瘤、降血糖等功效，并且具有一定的抗炎作用，提示其功能的发挥可能与血管内皮功能的改变相关。本研究首先对TMS用于细胞培养的药物毒性进行分析，结果显示在5、10μmol/L较低浓度时，TMS对HUVEs细胞的存活率影响较小，而在50、100μmol/L较高浓度时，细胞存活率明显下降，且呈时间、剂量依赖性。正常生理条件下血管内皮细胞在维持血管结构稳定的同时，可以分泌抗凝、抗血小板聚集、抗纤溶等物质，具有抗炎，防止中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞向血管壁黏附聚集的作用。而VED是指在病理条件(包括高血脂、高血糖、高血流切应力、氧自由基、内毒素等)刺激下，内皮细胞功能发生异常，主要包括两个方面：①血管收缩张力调节障碍;②内皮细胞释放的细胞黏附分子和炎症介质表达增加，而内皮细胞释放的内皮衍生松弛因子即NO和ICAM-1是这两方面的重要标志性分子。研究报道，内皮细胞在生理条件下，一氧化碳合酶(nitricoxidesyn-thase，NOS)维持在较低水平，而在病理情况下，例如SIRS、脓毒症、MODS、动脉粥样硬化等，NOS表达量增高，诱导NO释放增加，从而产生血管扩张、血流减慢、毛细血管通透性增高、促血小板凝集等现象，尤其在感染性休克的发生中其病理损害更为严重，可见NO在维持内皮细胞功能和完整性方面具有重要作用。本研究以LPS诱导HUVEs细胞，结果表明NO释放量在LPS组中显著增高，而不同浓度TMS进行干预后，NO释放量呈下降趋势，这提示TMS对内皮细胞具有一定的保护作用;以NF-κB抑制剂PDTC进行干预后，NO的释放量也呈下降趋势，这与邓炎辉等的报道相似。由于不同浓度TMS对HUVEs细胞的毒性具有一定影响，本研究选择中浓度TMS(10μmol/L)进行后续实验。ICAM-1可促进白细胞与内皮细胞之间的黏附力，在诱导血管通透性增高及新生血管产生过程中具有重要作用。本研究中，以LPS诱导HUVEs细胞后，在基因和蛋白水平上检测到ICAM-1表达增高，同时这种增高伴有NF-κB亚基p65蛋白和基因表达的增高，这与Jia等的研究相似。以中浓度TMS进行干预后，ICAM-1及NF-κB在mRNA和蛋白水平表达均下降，推测TMS对LPS诱导血管内皮细胞表达ICAM-1分子的抑制有可能是通过NF-κB细胞信号通路所起的作用。研究表明，在经典的NF-κB细胞信号通路活化过程中，静息状态下的NF-κB分子以无活性状态存在于细胞质中，它与抑制因子IκB结合，组成一个三聚体p50-p65-IκB。在外界刺激下，经IκBs激酶催化IkBs磷酸化和泛素化，使NF-κB自身抑制剂IκBα被蛋白酶降解，活化NF-κB转位入细胞核，与参与相关炎症反应分子的DNA基序结合以诱导靶基因转录等。同时，编码抑制物IκBα基因转录，促其再回到细胞质中恢复静息状态。本研究结果表明，TMS与NF-κB抑制剂PDTC具有类似的效应，都能使LPS诱导的ICAM-1及NF-κB表达降低、IκBα蛋白表达增高。细胞免疫荧光检测结果显示，NF-κB p65蛋白在CON组细胞核中无表达，而在LPS组发现了明显的细胞核绿色荧光且为强表达;在中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组中，NF-κBp65蛋白荧光表达相对LPS组减弱，且无细胞核荧光表达，即抑制了NF-κBp65蛋白的核移，这些都支持以上提出的假设。ICAM-1基因启动子上有1个基本的NF-κB位点，在TNF-α、IL-1、LPS及活性氧等作用下，NF-κB能在30min内使ICAM-1基因活化升高，并持续很长时间，且其表达升高与刺激物质呈时间、剂量依赖性。NF-κB活化后，可增强TNF-α、IL-1β、IL-2的基因转录，促其产生和释放增加，进而再次激活NF-κB;同时还可使IL-6、IL-8等促炎症因子产生及释放增多，从而导致最初的炎症信号进一步放大，加重机体损伤及微循环障碍，直至弥散性血管内凝血或死亡，这些病理生理异常多见于脓毒症和急性呼吸窘迫综合征等。综上所述，TMS可降低LPS诱导的血管内皮细胞NO和ICAM-1的表达，在一定程度上具有改善VED的作用。该研究可为TMS作为内皮细胞保护性药物的开发和利用提供一定的实验依据。