山茱萸总苷分离纯化工艺研究药学论文.doc

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山茱萸总苷分离纯化工艺研究_药学论文作者：李小娜吕立勋周洁徐海燕陈苹苹【摘要】目的应用大孔吸附树脂对山茱萸中环烯醚萜苷类成分进行分离纯化，考察大孔树脂纯化山茱萸总苷的工艺参数。方法考察上样量、洗脱剂浓度、洗脱体积、上样浓度等因素对HPD-100大孔吸附树脂纯化山茱萸环烯醚萜苷的影响。以洗脱液中莫诺苷和马钱苷含量作为考察指标，用HPLC法测定其含量，确定最佳工艺参数。结果洗脱溶剂应为50%乙醇，大孔树脂每使用两次需要再生1次，最佳上样浓度为0.25 g/ml，洗脱溶剂的用量为8倍的吸附原液体积，吸附容量为10 ml。结论采用大孔树脂分离纯化的山茱萸总苷可用于制备环烯醚萜苷制剂。【关键词】山茱萸总苷；大孔吸附树脂；高效液相色谱法；纯化Abstract：ObjectiveTo study the technological parameters of purification of total glycoside from Cornus officinalis with macroporous resin.MethodsThe sample volume,elution concentration,volume and sample concentration were observed and compared with those elution solvents.The purification of iridoid glycosides was evaluated with contents of morroniside and loganin by HPLC methods．ResultsEluting solvent was 50%ethanol,the macroporous resin used twice necded to be renewed,the best sample concentration was 0.25 g/ml,the volume of eluting solvent was eight times the of volume of sample solution,the absorption capacity was 10ml.ConclusionIridiod glycoside can be purified by macroporous．It is a feasible method to produce preparation．Key words：Total glycosides from Comus officinalis;Macroporous resin;HPLC;Purification山茱萸总苷(Total glucosides from Cornus officinalis，TGC)为中药山茱萸的主要药效部位，包括马钱苷（loganin）、莫诺苷（morroniside）、獐牙菜苷、马鞭草苷、山茱萸新苷等十余种环烯醚萜苷，已经证实能够降血糖并对糖尿病心脏和肾病病变有一定的保护作用［1～3］，有抗炎、免疫抑制作用［4～6］，对阿尔采末病和脑梗塞有治疗作用［7～8］。大孔吸附树脂对单味中药提取物中苷类、黄酮、生物碱的分离纯化效果良好［9，10］。本工艺应用大孔吸附树脂对山茱萸中环烯醚萜苷类成分进行分离纯化，并考察大孔树脂纯化山茱萸总苷的参数。1仪器与试药1.1仪器Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；KDC-16H高速型离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；BT125D十万分之一天平（塞多利斯精密科学仪器有限公司）；Heidolph2旋转蒸发仪。1.2药品与试剂山茱萸药材购于唐山市医药药材公司；马钱苷、莫诺苷对照品（自提取、精制，经1H-NMR和13C-NMR确定为马钱苷和莫诺苷，归一化法测定含量大于99.3%）；HPD-100大孔树脂（沧州宝恩化工有限公司）；甲醇为色谱纯（Fisher ChemAlert），其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。2方法与结果2.1山茱萸吸附原液的制备称取山茱萸粉（40目）200 g，加8倍量30％乙醇浸泡过夜，回流提取2次，1 h/次，过滤，合并滤液，滤液回收乙醇，浓缩制成每毫升相当于0.25 g生药的溶液，静置，滤过，即得山茱萸吸附原液，4℃保存备用。2.2大孔吸附树脂预处理与再生大孔吸附树脂一般含有未聚合的单体及残留溶剂，使用前须先行除去。树脂用95%乙醇浸泡24 h，倾去上浮物后湿法装柱，用乙醇洗至流出液与水混合不呈现白色乳浊现象即可，然后以大量蒸馏水洗净柱中乙醇，水浸泡备用；再生时用90％乙醇洗脱至流出液无色，以大量水洗去乙醇即可。如果树脂颜色较深，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液浸泡2 h，用水洗至中性，再加0.1 mol/L盐酸溶液浸泡2 h，用水洗至中性，最后用95%乙醇洗至洗脱液与等体积水混合不浑浊，用蒸馏水洗至无醇，备用。2.3山茱萸总苷中莫诺苷和马钱苷的含量测定2.3.1色谱条件色谱柱为Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-水溶液梯度洗脱，洗脱剂甲醇在0～8 min为32%，在8～15 min为32%～36%，在15～20 min为36%；柱温为室温；流速1 ml/min；检测波长237 nm；进样量20μl。2.3.2标准曲线与线性范围配制莫诺苷和马钱苷的系列对照品溶液，20μl进样分析。以莫诺苷和马钱苷的峰面积（Y）为纵坐标，莫诺苷和马钱苷的浓度（C）为横坐标，经回归处理得标准曲线的回归方程。其中莫诺苷为Y=25 404C+21.01（r=0.999 5），马钱苷为Y=20 518C+25.36（r=0.9993）。莫诺苷和马钱苷在0.013 6～0.533 mg/ml范围内线性良好。2.4 HPD-100大孔树脂纯化山茱萸总苷工艺参数的研究2.4.1洗脱溶剂的确定取HPD-100大孔树脂20 g，湿法装柱，预处理后备用。分别取0.25 g/ml的吸附原液5 ml，5支大孔树脂柱上样，通过进行动态吸附。用水洗脱树脂柱至洗脱液近无色，再用10%，30%，50%，70%，95%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，定容50ml，测定莫诺苷和马钱苷的含量。结果见表1。由表1可知山茱萸总苷最佳洗脱剂为50%乙醇。2.4.2大孔树脂使用次数的确定在“2.4.1”条件下，将树脂处理后再进行第2次和第3次上样洗脱，考察树脂的重复利用情况，根据莫诺苷和马钱苷的含量确定树脂使用次数。结果见表1。由表1可知SPF-100大孔树脂的最佳洗脱次数为两次。表1洗脱溶剂及树脂使用次数测定结果（略）2.4.3最佳上样浓度的确定取不同浓度（0.25，0.5，1，2 g/ml）的山茱萸吸附原液5 ml，用50%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，定容50 ml，测定莫诺苷和马钱苷的含量。结果见表2。由表2可知SPF-100大孔树脂的最佳上样浓度为0.25 g/ml的吸附原液。表2不同上样浓度的含量测定结果（略）2.4.4洗脱溶剂的用量分别取0.25 g/ml的吸附原液5 ml，大孔树脂柱上样，用水洗脱树脂柱至洗脱液近无色，再分别用50%乙醇30 ml(6倍），40 ml(8倍），50 ml（10倍）洗脱，收集洗脱液，定容50 ml，测定莫诺苷和马钱苷的含量。结果见表3。由表3可知SPF-100大孔树脂的洗脱溶剂的用量10倍的吸附原液体积，但综合考虑洗脱溶剂用量及回收溶剂等因素，可选8倍量的洗脱溶剂。表3不同洗脱溶剂用量的含量测定结果（略）2.4.5吸附容量的测定分别取0.25 g/ml的吸附原液5，10，15，20 ml，大孔树脂柱上样，用水洗脱树脂柱至洗脱液近无色，再分别用50%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，定容50 ml，测定莫诺苷和马钱苷的含量。结果见表4。由表4可知SPF-100大孔树脂在吸附原液为5 ml时吸附最完全，但综合考虑，吸附原液为10 ml时效率最高。表4不同吸附容量的含量测定结果（略）3讨论大孔树脂精制苷类具有吸附容量大、洗脱效率高等优点，使马钱苷和莫诺苷的含量提高，在预处理的前提下不失为一种提取苷类的优良吸附剂。中药成分在树脂上的吸附可能为放热过程，低温有利于提高中药成分的比上柱量，因此上样前将吸附原液放冰箱低温处理可增大吸附量。吸附原液上柱前，必须进行抽滤或离心等预处理以除去沉淀和杂质，上样液愈澄清，山茱萸总苷的纯化率愈高，亦能提高树脂的使用寿命。曾采用紫外法测定山茱萸总苷的含量，但是经大孔树脂富集后得到的总苷在237 nm左右并没有最大吸收峰，加上紫外法干扰多，特别是在中药成分复杂的情况下很难确定其准确性，莫诺苷和马钱苷是山茱萸总苷中含量最高的两种环烯醚萜苷，约占总苷的85％，故选用了HPLC法同时测定莫诺苷和马钱苷的方法确定山茱萸总苷的分离纯化工艺。【参考文献】［1］陈霞,沈爱宝,钱东生.山茱萸不同提取部位对小鼠血糖的影响［J］.南通医学院学报,2004,24(4):365.［2］时艳,许惠琴.山茱萸环烯醚萜总苷对实验性糖尿病心脏病变的保护作用［J］.南京中医药大学学报,2006,22(1):35.［3］Xu HQ,Hao HP,Zhang X,et al.Morroniside protects cultured human umbilical vein endothelial cells from damage by high ambient glucose［J］.Acta Pharmacologica Sinica,2004,25(4):412.［4］赵世萍,陈玉武,郭景珍.山茱萸总甙的抗炎免疫抑制作用［J］.中日友好医院学报,1996,10(4):295.［5］李建民,周勇,张丽,等.山茱萸总甙对HUVEC表达ICAM-1、CD44的影响［J］.中国免疫学杂志,2000,16(11):604.［6］孟晶，唐仕波，李辰，等.山茱萸总甙对大鼠角膜移植排斥反应免疫抑制作用机制研究［J］.中国病理生理杂志，2005，21(5):927.［7］褚燕琦，李玮，张兰，等.山茱萸环烯醚萜苷对蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸拟阿尔采末病细胞模型的作用［J］.中国药理学通报，2006，22(8):960.［8］李林，李宇航，艾厚喜.山茱萸提取物对脑梗死大鼠大脑皮层一氧化氮与核转录因子κΒ表达的影响［J］.中国中药杂志，2005，30(21):1667.［9］皮文霞，蔡宝昌，潘扬，等.大孔树脂与活性炭富集山茱萸总苷的实验研究［J］.中国中药杂志,2002,27(8):583.［10］吴红，梁恒，吴道澄，等.大孔吸附树脂法分离纯化山茱萸总皂苷［J］.第四军医大学学报,2003,24(8):689.