特发性血小板减少性紫癜患儿外周血T细胞亚型的分析医学论文.doc

会员专享推荐 · 你可能也用得上更多

开通会员，畅读全站文档

本篇文档已为你保留

本篇文档价值 ~~¥35.00~~会员免费解锁

全文不限次阅读，剩余内容即刻解锁
高速下载通道，免排队、无等待
专属客服 1 对 1 答疑，优先响应
每日赠送下载券，本篇文档免费送

有 86 篇商业计划书正在上传

下载原文档

特发性血小板减少性紫癜患儿外周血T细胞亚型的分析_医学论文作者：肖红，刘仿，伍昌林，杨小猛【摘要】T细胞亚型分化漂移可能与一些自身免疫病的发病机制有关。本研究旨在通过分析特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）患儿外周血Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞的平衡状态，探讨T细胞亚群失衡在ITP发病机制中的作用。收集30例ITP患儿外周抗凝静脉血，分离纯化得T细胞，以PE标记的抗CRTH2单克隆抗体和Cy5标记的抗CD4、CD8单克隆抗体作双色流式细胞术检测，分析ITP患儿Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2比例的变化。结果显示：ITP患儿外周血T细胞与健康儿童相比，Th细胞百分率及Th/Tc比例明显下降（P﹤0.05），Tc细胞百分率无明显变化（P﹥0.05）；Th1及Th2细胞百分率明显下降（P﹤0.05），Tc1及Tc2细胞百分率无明显变化（P﹥0.05），Th1/Th2及Tc1/Tc2比例明显升高（P﹤0.05）。结论：ITP患儿外周血可能存在细胞免疫功能低下及T细胞亚群漂移，Th1及Tc1细胞比例升高，呈明显Th1类细胞优势，此结果说明T细亚群分化异常在ITP发病过程中起着重要作用。【关键词】特发性血小板减少性紫癜；T细胞亚群；Th/Tc;Th1/Th2；Tc1/Tc2；CRTH2 Analysis of Peripheral Blood T Cell Subsets in Children with Idiopathic Thrombocytopenic Purpura Abstract The pathogenesis of some autoimmune diseases has been considered to be related to abnormal differentiation of T cell subsets.This study was aimed at investigating the change of Th1-like and Th2-like cells balance in ITP children，and analyzing the role of T cell subsets disequilibrium in the pathogenesis of ITP.Peripheral blood T cells were collected from 30 ITP patients，the T-cells were isolated and purified.The ratios of Th/Tc，Th1/Th2 and Tc1/Tc2 in peripheral blood T cells were analyzed by immunofluorescence staining and bicolor flow cytometry(FCM)in vitro.The results showed that as compared with the ratios of Th1/Th2(48.76%±6.17%)and Tc1/Tc2(18.90%±4.12%)in healthy children，the ratios of Th1/Th2(56.21%±5.95%)and Tc1/Tc2(23.09%±3.31%)in ITP children increased obviously.FCM analysis revealed that average percentages of Th，Th1，Th2，Tc，Tc1 and Tc2 were 22.31%±6.51%，21.92%±6.42%，0.39%±0.14%，31.12%±6.15%，30.95%±5.45%and 1.34%±0.84%in ITP children versus 39.24%±5.82%，39.01%±5.47%，0.80%±0.16%，30.25%±5.63%，28.72%±5.20%and 152%±0.68%in healthy children.The average percentages of Th，Th1 and Th2 decreased obviously，while the average percentages of Tc，Tc1 and Tc2 did not changed.It is concluded that the ratios of Th1/Th2 and Tc1/Tc2 in peri-pheral blood T cells increase obviously in ITP children and the cellular immunity in ITP children shiftes to Th1 type immunity superiority，which suggest that the abnormal differentiation of T cell subsets may play an important role in the pathologic process of ITP.Key words idiopathic Thrombocytopenic Purpura；T cell subset;Th/Tc;Th1/Th2；Tc1/Tc2；CRTH2特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是一种发病机制尚未完全明了的自身免疫性疾病。目前发现，ITP的发生、发展与患者体内Th1类/Th2类细胞的平衡失调有关［1、2］。目前认为，CRTH2(chemoattractant receptor-homologs molecule expressed on Th2 cells)是Th2、Tc2特异性表面标志物［3］，本研究应用PE标记的抗CRTH2单克隆抗体和Cy5标记的CD4、CD8作双色流式细胞术检测ITP患儿及健康儿童外周血的T细胞各亚群的百分率。分别以CD4＋CRTH2-T、CD4＋CRTH2＋T、CD8＋CRTH2-T及CD8＋CRTH2＋T细胞代表Th1、Th2、Tc1及Tc2细胞，分别以CD4＋T、CD8＋T细胞代表Th、Tc细胞，并进一步探讨Th1类/Th2类细胞在ITP发病机制中的作用。材料和方法研究对象30例ITP患儿均为广东医学院附属医院的患者，男14例，女16例，年龄3个月-12岁，中位年龄3.4岁，诊断均符合ITP诊断标准［4］，并于用药前取外周抗凝血。正常对照30例，为健康儿童，排除ITP及其它自身免疫病，其中男13例，女17例，年龄1-10岁，中位年龄5.3岁。主要试剂和仪器Cy5标记抗CD4、CD8单克隆抗体为EB公司产品，PE标记的抗CRTH2单克隆抗体为Miltenyibiotec公司产品，流式细胞仪为Beckman公司产品（型号为EPICS-XL），T细胞分离富聚柱（h CD3+T Cell Enrichment Column）为Becton Dickinson公司产品，淋巴细胞分离液(密度为1.077)为Axis-Shield公司产品。外周血T细胞的分离无菌采集患儿及正常健康儿童外周静脉血5 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞。放于无菌玻璃培养皿内在37℃下培养30分钟，去除黏附于玻璃培养皿的单核细胞，以获取悬浮的淋巴细胞。加入0.85%NH4Cl溶液溶解红细胞，经T细胞分离富聚柱采用负筛选法获得获纯化的T细胞。用20%的小牛血清RPMI 1640培养液调整细胞浓度约2×106/ml。S-AP/P免疫组织化学法检测其纯度大于98%，台盼蓝拒染法检测其活性大于95%。T细胞亚群的测定取3支试管，各加入100μl T细胞悬液，3管分别加入小鼠抗人单克隆IgG1-PE和小鼠抗人单克隆IgG1-Cy5（阴性对照管）、抗CD4-Cy5和抗CRTH2-PE（CD4+管）、抗CD8-Cy5和抗CRTH2-PE（CD8+管），各种标记抗体均15μl。混匀，4℃避光30分钟，PBS洗涤2次，各管加入0.5 ml缓冲液，上流式细胞仪检测。统计分析所有结果以X±SD表示，两两比较采用成组t检验，经SAS 8.22软件分析（α=0.05）。结果Th、Tc、Th/Tc的检测ITP患儿外周血Th细胞百分率及Th/Tc比例明显下降，与正常儿童比较差别有统计学意义（P﹤005）；Tc细胞百分率无明显变化，与正常儿童比较差别无统计学意义（P﹥0.05）（表1、图1）。Table 1.Determination of T subsets:Th and Tc（略）Th1/Th2、Tc1/Tc2的检测ITP患儿外周血Th1，Th2细胞百分率明显下降，与正常儿童比较差别有统计学意义（P﹤0.05）；Tc1，Tc2细胞百分率无明显变化，与正常儿童比较差别无统计学意义（P﹥0.05）；Th1/Th2及Tc1/Tc2比例升高，与正常儿童比较差别有统计学意义（P﹤0.05）（表2、图2）。Table 2.Determination of T subsets:Th1/Th2 and Tc1/Tc2（略）讨论自身免疫性疾病是临床上常见的一类疾病，然而自身免疫性疾病的发病机制十分复杂，目前尚未完全明了。研究资料表明，Th/Tc细胞的平衡在自身免疫性疾病的发生、发展过程中起重要作用［5］。CD4是T辅助/诱导细胞（Th/Ti）的表面标志，CD4+T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能，起辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。CD8是T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc）的表面标志，CD8+T细胞具有细胞毒效应，它能抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体，起抑制细胞及体液免疫的作用。Th细胞是机体免疫应答的中心细胞，CD4+/CD8+T（Th/Tc）比例变化反应机体的免疫功能状况，比例升高表明免疫功能亢进，比例降低表明免疫功能低下。本研究发现，ITP患儿CD4+T（Th）百分率及CD4+/CD8+（Th/Tc）比例均明显降低，CD8+T（Tc）百分率无明显变化。这一结果提示，ITP患儿体内存在细胞免疫调节异常，ITP患儿可能存在T细胞免疫功能低下。但很多学者研究认为，ITP患者体内活性T细胞增多，细胞免疫增强，引起了血小板的损伤［6，7］，这与我们的研究结果并不矛盾，后者是由于活性T细胞凋亡不足，对ITP患者血小板具有损伤作用的活性T细胞比例增加的结果［8］，但ITP患者总体免疫功能可能下降。人类CD4+T细胞根据其分泌的细胞因子不同至少可分为Th0、Th1、Th2三个亚群。Mosmann等［9］将Th1/Tc1、Th2/Tc2细胞分别称为Th1类、Th2类细胞。Th细胞间的平衡状态与多种疾病的发生、发展密切相关。Alves等［10］认为，Th1/Th2细胞间的平衡是体内体液免疫及细胞免疫间重要的调节枢纽，因此深入探讨Th1类/Th2类细胞平衡对研究包括ITP在内多种自身免疫病有重要意义，然而，长期以来，一直缺乏一种特异性表面标志以区别Th1类/Th2类细胞。近年来有研究发现，CRTH2是检测人Th2和Tc2最为可靠的表面标志。Cosmi等［3］研究认为，尽管不是所有的CRTH2＋T细胞产生Th2型的细胞因子，然而CRTH2＋T细胞仅包括Th2或Tc2细胞，而不包括Th0或Tc0细胞，亦不包括Th1或Tc1细胞。Tsuda等［11］的实验也表明，CRTH2表达于Th2和Tc2细胞表面，而不表达于Th1和Tc1细胞表面。Nagata等［12］报道，健康人外周血单个核细胞中CD4＋T细胞CRTH2的表达率为0.4%-6.5%，本研究以PE标记的抗CRTH2单克隆抗体测得的正常儿童外周血T细胞中CD4＋CRTH2＋T（Th2）细胞的表达率为（0.80±0.16）%，与Nagata等的结果相似。CRTH2是一种新的G蛋白偶联受体，与C5a受体和FMLP(甲酰甲硫氨酰－亮氨酰－苯丙氨酸)受体高度同源，IL-4能够上调其表达，而IFN-γ则下调其表达。CRTH2同时也是前列腺素D2的一种受体，参与白细胞的迁移，可能与炎症反应有关，其具体功能目前尚不清楚。ITP是一种儿童常见的自身免疫性疾病，临床以血小板减少，皮肤、黏膜出血为特征。主要是由于抗血小板自身抗体导致血小板破坏增加所致。然而越来越多的资料显示，除体液免疫机制外，在ITP尤其是慢性ITP的发病过程中，细胞免疫起着非常重要的作用。本研究应用流式细胞术检测纯化的外周血T细胞，分别以CD4＋T细胞，CD8＋T细胞代表Th、Tc细胞，以CRTH2区分Th1类和Th2类细胞。我们发现，ITP患儿外周血Th1类/Th2类细胞间失衡，呈现明显Th1类优势，这一结果与Anderson等报道一致［13］。同时，我们发现，尽管ITP患儿Th细胞下降，Tc细胞无明显变化，然而Th1/Th2及Tc1/Tc2比例均明显升高，提示在ITP的发病过程中，Th1类/Th2类比例较Th和Tc细胞数所起的作用更为明显。ITP患儿体内Th1类/Th2类比例升高，细胞免疫应答增强，提示机体自身反应性细胞免疫功能亢进。在ITP发生发展过程中，Th1细胞可通过分泌IL-2，IFN-γ等细胞因子，激活细胞毒T细胞、巨噬细胞，吞噬杀伤血小板；而活化的Tc1细胞，也就是通常所说的Tc细胞，则能通过分泌穿孔蛋白、颗粒酶特异性地杀伤血小板。我们的研究表明，对Th1类/Th2类细胞平衡在自身免疫病中作用的研究，不仅有助于阐明自身免疫性疾病的发病机制，而且有可能为我们提供治疗自身免疫性疾病的新方法，即通过调节Th1类/Th2类细胞的动态平衡，来调节过强的自身反应性体液免疫或细胞免疫，达到治疗自身免疫性疾病的目的。【参考文献】1 Mouzaki A，Theodoropoulou M，Gianakopoulos I，et al.Expression patterns of Th1 and Th2 cytokine genes in childhood idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP)at presentation and their modulation by intravenous immunoglobulin G(IVIg)treatment:their role in prognosis.Blood，2002;100:1774-1779 2周平，吕枫林，姚咏明等.特发性血小板减少性紫癜患儿T细胞免疫功能的变化.中华儿科杂志.1999;37:12-14 3 Cosmi L，Annunziato F，Galli MIG，et al.CRTH2 is the most reliable marker for the detection of circulating human type 2 Th and type 2 T cytotoxic cells in health and disease.Eur J Immunol，2000;30:2972-2979 4张之南，主编.《血液病诊断及疗效标准》.第2版.北京:北京科学出版社.1998:279-281 5 Haggqvist B，Hultman P.Effects of deviating the Th2-response in murine mercury-induced autoimmunity towards a Th1-response.Clin Exp Immunol，2003;134:202-209 6 Yoshimura C，Nomura S，Nagaham M，et al.Plasma-soluble Fas(Apo-1，CD95)and soluble Fas ligand in immune thrombocytopenic purpura.Eur J Haematol，2000；64:219-224 7 Olsson B，Andersson PO，Jernas M，et al.T-cell-mediated cytotoxicity toward platelets in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura.Nat Med，2003;9:1123-1124 8刘仿，肖红，孟琼等.特发性血小板减少性紫癜淋巴细胞凋亡及凋亡蛋白表达的研究.中国免疫学杂志，2004;20:202-205 9 Mosmann TR，Sad S.The expanding universe of T-cell subsets:Th1，Th2 and more.Immunol Today，1996;17:138-146 10 Alves CR，Benevolo-De-Andrade TC，Alves JL，et al.Th1 and Th2 immunological profile induced by cysteine proteinase in murine leishmaniasis.Parasite Immunol，2004;26:127-135 11 Tsuda H，Michimata T，Sakai M，et al.A novel surface molecule of Th2-and Tc2-type cells，CRTH2 expression on human peripheral and decidual CD4+and CD8+T cells during the early stage of pregnancy.Clin Exp Immunol，2001;123:105-111 12 Nagata K，Tanaka K，Ogawa K，et al.Selective expression of a novel surface molecule by human Th2 cells in vivo.J Immunol，1999;162:1278-1286 13 Andersson J.Cytokines in idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP).Acta Paediatr Suppl，1998;424:61-64.