当归抗β-淀粉样蛋白所引起的神经细胞毒性作用研究药学论文.doc

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当归抗β-淀粉样蛋白所引起的神经细胞毒性作用研究_药学论文作者：顾然，刘如玉，张蓝江，郝小燕，肖雁，齐晓岚，单可人，任锡麟，官志忠【摘要】目的研究当归对β-淀粉样蛋白引起的SH-SY5Y神经细胞中尼古丁受体亚单位在蛋白质水平降低、细胞损伤及脂质过氧化的拮抗作用，了解其神经保护作用的可能机制。方法选取一定浓度的当归预处理SH-SY5Y细胞后，再加入β－淀粉样蛋白处理，用比色法测定细胞MTT还原率，从细胞整体水平了解当归对细胞活性的影响；用Western blotting方法测定神经型尼古丁受体亚单位（α3和α7）蛋白表达水平的变化；用TBA比色法测定脂质过氧化产物（丙二醛）的水平，以了解当归的抗氧化能力。结果安全浓度的当归提取物能减弱β－淀粉样蛋白引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高，对抗β－淀粉样蛋白引起的α3和α7尼古丁受体亚单位蛋白质水平降低。结论当归有一定的神经保护作用。【关键词】当归；SH-SY5Y细胞；尼古丁受体；β-淀粉样蛋白；脂质过氧化Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of Angelica on the neurotoxicity and the decreased expression of nAChRs induced by b-amyloid peptide(Ab)in human neuroblastoma(SH-SY5Y)cells.MethodsThe SH-SY5Y cells were treated by a certain concentration of angelica,and then exposed to 10 ml Aβ25-35.MTT reduction assay was carried out to detect the cell viability,lipid peroxidation was measured by TBARS to observe the level of oxidative stress,and the expression of nicotinic receptorα3 orα7 subunits at protein level was detected by Western blot.ResultsAngelica at a safety-dose inhibited the neurotoxicity and the increased lipid peroxidation,and prevented the decreased expression ofα3 andα7 nAChR subunit protein in SH-SY5Y cells induced by Aβ.ConclusionAngelica can play an important role in neuroprotection.Key words：Angelica;SH-SY5Y cells;nAChR;β-amyloid pepitide;Lipid peroxidation阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以智力缓慢性进行性丧失为特征的神经退变性疾病，是痴呆病中最常见的类型［1］。AD的病因及发病机制至今尚不十分清楚，目前认为AD是由遗传学因素、环境因素和代谢因素等多种因素共同作用所引起的一种疾病，病理学上以脑细胞内神经原纤维缠结及细胞外老年斑形成为主要特征［2］。老年斑的主要成分为β淀粉样蛋白(β-Amyloid protein,Aβ)，是一种神经毒性物质，可损伤大脑皮层与海马等与记忆相关脑区结构与功能，在AD发病机制中起关键作用。神经型尼古丁乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)（或称尼古丁受体）与学习和记忆等认知功能密切相关，并具有明显的神经保护作用［3，4］。在较早的一些研究中就发现，AD患者大脑皮层尼古丁受体出现持续的和严重的丢失，大脑皮层的尼古丁受体缺失与AD患者的认知障碍有显著的相关性。当归为伞形科植物当归（Angelica sinensis）的干燥根，当归入药，历史悠久，应用广泛，有“十方九归”之说。近年很多研究表明以当归作为主要药材的复方中药制剂具有改善痴呆小鼠学习记忆障碍的作用［5，6］，但是当归所起的作用及其相关机制目前还不清楚。因此本研究用Aβ25-35处理来源于人脑的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞作为研究对象，以初步了解当归对Aβ引起的尼古丁受体表达降低及细胞毒性损害的拮抗作用，为当归在AD治疗中的应用提供理论依据。1材料与方法1.1材料与试剂当归药材产于甘肃，购于贵阳市三桥药材市场，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定。当归水煮提取物制剂由贵阳医学院药学院提供，浓度为：1 g生药/ml；源于人脑的神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y细胞）购自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司；Aβ25-35购自Sigma公司；DMEM培养液购自Gibco Introvagen公司；小牛血清购自华美公司；MTT比色法主要试剂购自Sigma公司；羊抗a3、a7及鼠抗β-肌动蛋白（β-Actin)多克隆抗体及HRP标记的抗羊及抗鼠二抗购自Santa Cruz Biotechnology公司；聚乙烯二氟（PVDF）膜、ECL-Plus发光试剂、高效显影胶片购自Amersham公司；TBA比色法试剂盒购自南京建成公司；其它化学试剂均购自Sigma公司。1.2方法1.2.1细胞培养用含10%小牛血清、双抗（青霉素25 U/ml，链霉素25 U/ml）的DMEM作为培养基，5%CO2、饱和水气、37℃恒温培养。1.2.2 3-4,5-二甲基噻唑-2，5-二酚四唑溴化物［3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］比色法筛查中药安全浓度比色法测定MTT水平［7］，测定波长为490 nm，常用来表示细胞的损伤程度和功能状况。向96孔细胞培养板中，加入一定数量（约1×104/孔）待检测细胞，加入当归水煮提取物，终浓度分别为：0，0.05，0.25，0.5，1，2.5，5，10，25 mg/ml培养24 h后测定MTT水平。1.2.3细胞分组诱导及相应的药物干预对照组：不经药物处理，培养期为48 h。Aβ处理组：在培养的细胞中加入10μM Aβ25-35，培养时间为48h（细胞培养前将Aβ25-35用PBS溶解后，37℃孵育3～4h，以保证获得有毒性作用的聚集性Aβ）。单纯中药处理组：加入中药培养48 h。中药和Aβ处理组：先加入中药培养24 h后，再按照Aβ处理组的方法进行处理。1.2.4药物处理后MTT还原率测定向96孔细胞培养板中，加入一定数量（约1×104/孔）待检测细胞，分组药物处理细胞后测定MTT水平。1.2.5尼古丁受体亚单位蛋白表达测定参照Guan等［8］的方法进行提取细胞膜蛋白及用蛋白印迹（Western blotting）方法检测尼古丁受体α3，α7亚单位蛋白水平。以Labworks软件分析结果时以β-Actin蛋白条带作为内参照，计算α3，α7蛋白条带与β-Actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为α3，α7亚单位蛋白质表达的相对计量水平比。1.2.6脂质过氧化水平测定收集培养神经细胞的培养液，测定丙二醛（脂质过氧化的中间产物）含量，测定波长为532 nm，操作按照试剂盒说明书进行。1.2.7统计学分析将每组所得结果用±s表示，结果用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析。2结果2.1中药安全浓度筛查当归水煮提取物浓度＞5 mg/ml时SH-SY5Y神经细胞MTT还原率出现下降趋势，浓度＞10 mg/ml时细胞MTT还原率明显降低，表明当归浓度过高对细胞有毒性作用。因此选择2.5 mg/ml作为本次研究当归水煮提取物的安全浓度。见图1。以不同浓度的当归水煮提取物处理细胞24 h,测定SH-SY5Y神经细胞MTT还原率，结果用单因素方差分析法统计分析（n=6），**表示与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）2.2药物处理后MTT还原率药物处理后测定MTT还原率测定发现，10μM Aβ25-35处理细胞后引起MTT还原率明显降低；2.5 mg/ml当归处理不影响细胞功能；而用当归预处理细胞后可减弱Aβ对细胞的毒性作用，Aβ组与当归+Aβ组之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2。2.3尼古丁受体蛋白表达水平2.3.1尼古丁受体α7亚单位蛋白质表达水平半定量结果10μM Aβ25-35处理细胞后引起尼古丁受体α7亚单位蛋白质表达水平明显降低；2.5 mg/ml当归处理不影响该受体蛋白水平；而用当归预处理细胞后可减弱Aβ对细胞α7亚单位蛋白质表达水平的下调作用，Aβ组与当归+Aβ组之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。细胞分组及相应的药物处理后，测定SH-SY5Y神经细胞MTT还原率，结果用单因素方差分析法统计分析（n=6），*表示与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），**表示与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。Con：对照组;Aβ：Aβ处理组;AS：单纯当归处理组;AS+Aβ：当归和Aβ处理组细胞分组及相应的药物处理后，用Western blotting法测定SH-SY5Y神经细胞α7尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平，结果用单因素方差分析法统计分析（n=6），*表示与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），**表示与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。Con：对照组;Aβ：Aβ处理组；AS：单纯当归处理组；AS+Aβ：当归和Aβ处理组；α7：α7尼古丁受体亚单位；β-Actin：β-肌动蛋白。上方为统计分析结果，下方分别为α7和β-Actin Western blotting结果2.3.2尼古丁受体α3亚单位蛋白质表达水平半定量结果10μM Aβ25-35处理细胞后引起尼古丁受体α3亚单位蛋白质表达水平明显降低；2.5 mg/ml当归处理不影响该受体蛋白水平；而用当归预处理细胞后可减弱Aβ对细胞α3亚单位蛋白质表达水平的下调作用，Aβ组与当归+Aβ组之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。见图4。细胞分组及相应的药物处理后，用Western blotting法测定SH-SY5Y神经细胞α3尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平，结果用单因素方差分析法统计分析（n=6），*表示与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），**表示与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。Con：对照组；Aβ：Aβ处理组；AS：单纯当归处理组；AS+Aβ：当归和Aβ处理组；α3：α3尼古丁受体亚单位；β-Actin：β-肌动蛋白。上方为统计分析结果，下方分别为α3和β-Actin Western blotting结果图4 SH-SY5Y神经细胞药物处理后尼古丁受体α3亚单位蛋白质表达水平2.4 TBA法测定MDA水平结果表明，10μM Aβ25-35处理细胞后引起细胞脂质过氧化水平明显升高；2.5 mg/ml当归处理不影响MDA含量；而当归预处理细胞后可减弱Aβ所引起的脂质过氧化水平升高，Aβ组与当归+Aβ组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。3讨论目前认为，Aβ是一种具有神经毒性作用的物质，由39～43个氨基酸构成，神经毒性必需结构是Aβ中25～35的氨基酸序列（Aβ25-35）。Aβ由β-淀粉样蛋白前体蛋白（β-Amyloid precursor protein,APP）通过β-分泌酶和γ-分泌酶参与的β裂解过程产生［9］。近来有研究表明［10］，β-淀粉样蛋白造成的损伤作用是AD发生发展的首要因素，其损伤机制之一是通过增强氧化应激反应和释放自由基产物，从而引起神经元受损。本研究以Aβ25-35处理来源于人类的SH-SY5Y神经细胞，模拟AD患者脑内神经细胞的病理过程，以此作为当归水煮提取物体外研究的类似AD细胞模型。研究结果显示，与对照组相比，Aβ25-35处理组SH-SY5Y神经细胞的MTT还原率明显降低，MDA水平明显升高，同时尼古丁受体a3和a7亚单位表达明显下降。这一结果与许多文献报道是一致的［8］，表明Aβ25-35可造成细胞损伤，细胞脂质过氧化水平升高，尼古丁受体表达下调，这些表现与AD患者脑内的神经细胞受损情况很类似。尼古丁受体是神经系统中一类非第二信使介导性神经递质结合的离子通道，是一类明确的具有神经保护功能的受体，其减少与AD的发生有关。AD患者脑内尼古丁受体-配体结合率降低，其亚基的蛋白表达水平也降低。在SH-SY5Y神经细胞中，α3和α7是主要的尼古丁受体亚单位。本研究中，通过测定尼古丁受体α3和α7亚单位蛋白质水平发现，Aβ25-35能够明显降低α3，α7亚单位蛋白质的表达。当归水煮提取物对Aβ25-35所导致的α3，α7亚单位蛋白质表达降低有拮抗作用。实验还发现，当归水煮提取物预处理的SH-SY5Y神经细胞能够对抗Aβ引起的MTT还原率降低，表明该中药具有抗Aβ细胞毒性的作用。对MDA水平的测定表明，当归水煮提取物具有抗脂质过氧化作用。当归水煮提取物成分复杂，其抗脂质过氧化作用的机制目前不是很清楚，可能与其中的有效成分（如：当归多糖，阿魏酸等）能增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，减少内源程序性SOD的消耗，有效地清除超氧自由基，减少脂质过氧化反应，从而降低MDA的水平［11］。这可能也是当归拮抗Aβ25-35引起的α3，α7亚单位蛋白质表达降低的机制之一。另外，有研究显示，以当归作为主要药材之一的当归芍药散能够抑制Aβ聚集和形成纤维［12］，从而降低Aβ的毒性作用。这可能是当归拮抗Aβ25-35引起α3，α7亚单位蛋白质表达降低的另一条途径。总之当归正是通过多靶点、多途径发挥其抗Aβ细胞毒性的作用。综上所述，当归水煮提取物能对抗Aβ引起的尼古丁受体α3和α7亚单位蛋白质表达降低，对抗Aβ导致的细胞毒性作用及脂质过氧化，在AD的中药治疗中可能有一定疗效。当然，当归水煮提取物成分复杂，本研究又是体外实验，要了解其中抗Aβ的确切成分及其抗Aβ的确切机制以及在体内复杂的代谢环境中这些成分是否具有同样的抗Aβ作用，还需进一步研究。【参考文献】［1］Felician 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